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  • Monoliths for purification of a DNA vaccine against Influenza
    Publication . Bicho, Diana Stefanía Faria; Tomaz, Cândida Ascensão Teixeira; Queiroz, João António de Sampaio Rodrigues
    O vírus influenza é responsável por uma infeção muito contagiosa que afeta o sistema respiratório, convencionalmente designada por Gripe. Este vírus é constituído por uma cadeia simples de RNA “negative sense” pertencente à família Orthomyxoviridae. O vírus influenza apresenta vários antigénios de superfície como a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA). A HA é o glicopéptido responsável pela entrada do vírus nas células do hospedeiro e tem correlação direta com a proteção contra o vírus, uma vez que induz a produção de anticorpos neutralizantes. Vários estudos têm demonstrado que o insert HA contido nas vacinas de DNA usadas esperimentalmente permitem conferir protecção cruzada contra várias estirpes do vírus, o que justifica a sua escolha para este projecto. Por outro lado, a NA é responsável pela saída do vírus da célula infetada permitimdo a sua propagação. É de referir ainda a proteína M2, um canal proteico transmembranar responsável pela replicação do vírus. Segundo dados da organização mundial de saúde em dezembro de 2015, as infeções respiratórias são mais frequentemente causadas por influenza do tipo A e B, sendo que a elevada propagação do vírus pelos vários continentes contribui para a ocorrência de mutações e aparecimento de novas estirpes. Assim, todos os anos vários milhares de pessoas são hospitalizadas devido a complicações da gripe, havendo uma taxa de mortalidade considerável, em especial em indivíduos com idade superior a 65 anos e com patologias preexistentes. Deste modo, a prevenção passa pelo reforço anual do sistema imunitário o que é conseguido de forma mais rápida e efetiva mediante a aplicação de vacinas. O objetivo da vacinação é controlar ou diminuir os sinais de infeção e é especialmente importante para indivíduos de elevado risco. As vacinas convencionais contra influenza são preparadas sazonalmente e são específicas para uma determinada estirpe, ou seja, a imunidade gerada não é particularmente ampla e a sua eficácia depende do grau de correspondência entre a vacina e a estirpe circulante. Como alternativa, a utilização do DNA plasmídico (pDNA) como uma vacina não viral tem-se tornado numa potencial estratégia terapêutica para prevenir ou tratar determinadas doenças de forma menos invasiva e segura comparando com os vetores virais. A vacinação de DNA consiste na injecção de DNA bacteriano geneticamente modificado com o gene de interesse que expressa proteínas antigénicas responsáveis por desencadear uma resposta imunológica, evitando a progressão da doença. Estas vacinas oferecem uma série de vantagens quando comparadas às vacinas clássicas, em termos económicos e técnicos. O controlo de qualidade é mais fácil e a comercialização não necessita de uma rede de refrigeração, pois estas vacinas são estáveis à temperatura ambiente e podem ser liofilizadas. Além disso, as vacinas de DNA induzem uma resposta imunitária celular através da produção de linfócitos T auxiliares (CD4+) e linfócitos T citotóxicos (CD8+) e também uma resposta humoral por produção de linfócitos B. O pDNA usado na produção de vacinas deve conter vários elementos funcionais para garantir a sua propagação (origem de replicação procariótica) e seleção em microrganismo bacterianos (marcador de seleção, como por exemplo a resistência a um antibiótico). Adicionalmente, deve apresentar elementos responsáveis por uma elevada expressão nos hospedeiros eucarióticos (promotor de expressão eurariótica, sinal de poliadenilação, sítio de múltipla clonagem) e ativação do sistema imunitário (gene de interesse). O pDNA para fins terapêuticos deve estar em conformidade com as especificações das agências reguladoras, seguindo rigorosos critérios de qualidade em termos de uso de reagentes tóxicos ou de origem animal, bem como de pureza relativamente aos restantes constituintes dos lisados celulares. Contudo, as semelhanças existentes entre o pDNA e os seus contaminantes comuns, como proteínas, endotoxinas, DNA genómico e RNA, podem complicar a sua separação, pelo que o processo de purificação deverá ser extremamente eficiente. Portanto a preparação destas vacinas de DNA requer o desenvolvimento de processos de produção e purificação que permitam obter grandes quantidades de plasmídeo na sua forma mais compacta e biologicamente ativa (isoforma superenrolada (sc)). Hoje em dia qualquer processo para obtenção de vacinas de DNA requer a utilização de métodos cromatográficos para obtenção do plasmídeo sc na sua forma mais pura. A cromatografia é uma técnica quantitativa que tem por finalidade geral a identificação e a separação dos componentes de uma mistura. Os compostos presentes são distribuídos entre uma fase estacionária e uma fase móvel e a separação ocorre porque os compostos têm diferentes afinidades com a fase estacionária e com a fase móvel, portanto deslocam-se com diferentes velocidades. Os métodos cromatográficos exploram propriedades do pDNA como tamanho, hidrofobicidade, carga e a afinidade das suas bases para os ligandos, de modo a promover a separação das impurezas com a maior eficiência possível. A flexibilidade deste tipo de processo advém da grande variedade de suportes e ligandos que podem ser usados, tendo em conta as características da molécula a separar. Em relação aos suportes cromatográficas existentes, alguns problemas ainda precisam de ser ultrapassados, como a baixa capacidade de ligação dos suportes, o tempo do processo de purificação das biomoléculas e os rendimentos de recuperação. Apesar dos bons resultados obtidos com as matrizes convencionais há necessidade de utilizar novas matrizes com melhor performance. Os monolitos poderão ser uma alternativas às matrizes convencionais uma vez que mostram várias vantagens em relação a estas, nomeadamente: elevada capacidade de ligação devido às excelentes propriedades de transferência de massa; separação mais rápida o que leva a uma baixa degradação; resolução independente do caudal; fácil manuseamento e elevada reprodutibilidade. Desta forma, o trabalho apresentado nesta tese consistiu na utilização de colunas monolíticas com a finalidade de purificar a isoforma sc da vacina de DNA NTC 7482-41H-VA2 HA com 6.471kbp que contém o codão de iniciação e sequência necessária para expressar a HA do vírus influenza. Numa fase inicial, foram realizados vários ensaios com plasmídeos modelo de diferentes tamanhos (até 14 kbp) utilizando o monolito CarbonylDiImidazole (CDI) não derivatizado. Este ligando foi escolhido pelas suas semelhanças com a coluna histidina agarose previamente utilizada com sucesso na purificação de um plasmideo modelo. Plasmídeos maiores necessitaram de menor concentração de sal (sulfato de amónio) para ligar ao monolito devido ao maior número de interações entre estas biomoléculas e o monolito. A caracterização do suporte foi possível através da determinação da capacidade dinámica de ligação (DBC) por variação de parâmetros como o tamanho do plasmídeo, força iónica, caudal e o pH da fase móvel. Verificou-se que quanto maior concentração de sal usada, menor a repulsão electrostática dos grupos fosfato no pDNA, o que torna estas moléculas mais compactas aumentando a DBC. Por outro lado, observou-se que para o mesmo caudal, plasmídeos maiores possuem menor DBC, uma vez que ocupam maior área de superfície dentro dos canais do monolito. Por fim, constatou-se que a diminuição do pH também tem uma influência positiva na DBC. No seguimento do trabalho, foi também testado um supporte monolítico imobilizado com agmatina para a purificação da vacina de pDNA contra o vírus influenza. A agmatina é naturalmente sintetizada a partir do aminoácido arginina na forma descarboxilada, e é conhecida pela sua intervenção em inúmeros processos biológicos. As semelhanças estruturais da agmatina com o seu precursor arginina, previamente utilizado como ligando numa coluna de agarose para purificar sc pDNA, foram a razão de escolha para o propósito aqui referido. A agmatina foi pela primeira vez usada como ligando em processos cromatográficos, verificandose que possui a particularidade de funcionar sob dois modos de interação, o que permitiu a aplicação de duas estratégias de purificação: gradiente por diminuição da concentração de sulfato de amónio ou por aumento da concentração de cloreto de sódio. Os melhores resultados foram obtidos com a estratégia que usa sulfato de amónio, atingindo-se um grau de pureza de 98 % e um rendimento de 51,8 %. Adicionalmente, o método apresentou uma elevada DBC (5.656 mg/mL) e uma redução significativa das impurezas do hospedeiro quando comparadas com o lisado injectado no monolito. A eficiência de transfeção nos fibroblastos transfectados com o pDNA sc purificado com esta estratégia foi de 73 %. Por último, a implementação de uma abordagem baseada em cromatografia de troca iónica utilizando o monolito com o ligando etilenodiamina (EDA) para a purificação do pDNA sc com expressão do gene HA do vírus influenza foi também bem sucedida. Este último ligando funciona por troca aniónica e possui semelhanças estruturais com o ligando DEAE, previamente utilizado como método analítico para quantificação de impurezas e da isoforma sc em amostras de pDNA. O processo permitiu uma redução significativa das impurezas provenientes do hospedeiro E. coli obtendo-se um grau de pureza de 97,1% e um redimento de 47%. Após a verificação dos padrões de qualidade do pDNA sc purificado, foram realizados ensaios in vitro com 2 tipos de células (A549 e CHO). A expressão da HA determinada por imunofluorescência permitiu verificar uma maior eficiência de transfecção nas células CHO com cerca de 70,6 %, enquanto as células A549 apenas registaram uma eficiência de transfecção de 61,4 %. De entre todos os métodos cromatográficos utilizados, o EDA permitiu obter um processo mais rápido e com menor impacto económico. No global, este projeto de doutoramento demonstrou que os monolitos possuem um grande potencial de aplicação em processos cromatográficos para a purificação de vacinas de DNA obtidas a partir de lisados complexos de E. coli seguindo as exigências das agências reguladoras. Apesar de os monolitos utilizados com os ligandos acima referidos apresentarem valores de rendimento e purificação relativamente semelhantes às matrizes particuladas convencionais, a elevada capacidade dos monolitos permite uma maior rapidez e eficiência do processo de purificação.
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  • Genética molecular do hipogonadismo hipogonadotrófico idiopático
    Publication . Gonçalves, Catarina Inês Nunes Pires; Lemos, Manuel Carlos Loureiro de; Socorro, Sílvia Cristina da Cruz Marques
    O hipogonadismo hipogonadotrófico idiopático (HHI) é definido pela falência completa ou parcial do desenvolvimento pubertário devido à deficiente secreção de gonadotrofinas (FSH e LH) e hormonas sexuais (testosterona e estradiol), na ausência de qualquer causa orgânica hipotalâmico-pituitária. As formas congénitas do HHI incluem a Síndrome de Kallmann (SK), caracterizada pela deficiência gonadotrófica e uma deficiência do sentido de olfato (anósmia ou hipósmia), e HHI sem defeitos olfactivos (HHI normósmico). Esta condição pode ser detetada na infância pela presença de micropénis e/ou criptorquidia, em associação com baixos níveis de gonadotrofinas ou, mais frequentemente, na adolescência ou na idade adulta, pela ausência do desenvolvimento pubertário. Podem, ainda, surgir outros fenótipos não-reprodutivos, como defeitos da linha média facial, agenesia dentária, surdez, agenesia renal, sincinesia e anomalias ósseas digitais. Cerca de um terço dos pacientes com HHI revela um defeito genético em genes que regulam o desenvolvimento embrionário ou a migração dos neurónios secretores da hormona libertadora de gonadotrofinas (GnRH), ou a síntese, secreção ou ação da GnRH. Esta doença pode ter ainda um carácter oligogénico, uma vez que têm sido descritos casos de indivíduos com HHI e alterações genéticas em mais do que um gene. Embora raramente, existem pacientes, que após tratamento hormonal, evidenciam reversão espontânea do quadro de hipogonadismo. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência de mutações e prever as suas consequências funcionais, numa coorte de pacientes com HHI. Neste sentido, 50 pacientes com HHI foram estudados por sequenciação de genes associados a esta doença: KAL1, FGFR1, FGF8, CHD7, PROK2, PROKR2, KISS1R, TAC3, TACR3, GNRH1 e GNRHR. As consequências funcionais das mutações foram previstas por análises estruturais e de conservação in silico. Foram identificadas 43 variantes consideradas patogénicas (das quais 18 nunca foram descritas) em 30 dos 50 pacientes estudados, o que corresponde a uma frequência de causas genéticas de 60%. As variantes foram identificadas com diferentes frequências consoante o gene: KAL1 (7%), FGFR1 (25,6%), FGF8 (2,3%), CHD7 (39,5%), PROK2 (2,3%), PROKR2 (11,6%), KISS1R (2,3%) e GNRHR (9,3%). As análises in silico foram consistentes com um papel crítico das mutações na atividade das proteínas codificadas. Em sete famílias foram encontrados casos de oligogenia e num caso ocorreu reversão da doença, após interrupção do tratamento de reposição com testosterona. Não foi observada uma clara relação genótipo/fenótipo, no entanto, verificou-se que, tal como descrito na literatura existente, mutações no gene KAL1 podem ocorrer em pacientes com problemas renais e mutações no FGFR1 e CHD7 podem estar associadas a surdez. Em suma, neste estudo foi encontrada uma prevalência de 60% de mutações em casos de SK e de HHI normósmico. Identificaram-se 18 novas mutações patogénicas nos genes KAL1, FGFR1, CHD7, KISS1R, GNRHR e PROKR2, ampliando o espectro de mutações associadas ao HHI. O estudo possibilitou, ainda, confirmar o crescente carácter oligogénico que explica os casos de penetrância incompleta e variabilidade fenotípica, presentes em algumas famílias estudadas. Estes estudos poderão revelar-se de grande importância no aconselhamento genético, uma vez que pacientes em que foram identificadas mutações, podem ser alertados para a possível coexistência de outras malformações e para a probabilidade de outros familiares serem afetados pela mesma doença, podendo ser tomadas medidas que minimizem os seus efeitos nocivos.
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  • Biological evidence of the protective role of regucalcin in breast cancer
    Publication . Marques, Ricardo Jorge Fernandes; Socorro, Sílvia Cristina da Cruz Marques; Santos, Cecília Reis Alves dos
    O cancro da mama é uma doença heterogénea que compreende uma grande variedade de alterações moleculares e diferentes tipos de resposta em termos clínicos. Esta diversidade reside nos múltiplos fatores que podem levar à transformação maligna das células, em consequência da desregulação de diferentes processos fisiológicos. A regucalcina (RGN) é uma proteína de ligação ao cálcio (Ca2+) e cuja principal função conhecida é regular a homeostase do Ca2+ intracelular, mas podendo também estar envolvida na regulação da proliferação celular, apoptose e metabolismo das células. A RGN também foi identificada como um gene regulado por hormonas, incluindo os esteroides sexuais como os androgénios. Para além disso, foi anteriormente associada a determinadas patologias e tendo mesmo sido identificada como uma proteína subexpressa em casos humanos de cancro da mama, próstata ou fígado. No fígado, a subexpressão da RGN foi detetada em lesões pré-neoplásicas, ou seja, antes da aquisição do fenótipo neoplásico, o que sugere que a sua diminuição pode estar ligada ao início do processo de transformação tumorigénico. Apesar destas evidências, os mecanismos moleculares subjacentes às funções da RGN na mama permanecem por identificar. Nesta tese, colocámos a hipótese de que a sobreexpressão da RGN poderá exercer uma ação protetora em relação à carcinogénese mamária. De modo a avaliar esta questão, o composto 7,12 dimetilbenz[α]antraceneno, o qual é conhecido por induzir carcinogénese mamária em rato, foi administrado a ratos transgénicos que sobreepressam a RGN (Tg-RGN) e aos respetivos controlos (Wt, do inglês wild-type). Os ratos Tg-RGN apresentaram, notavelmente, uma menor incidência de tumores (25.8 %) comparativamente aos animais controlo (100 %). A classificação histológica também demonstrou uma clara resistência dos ratos Tg-RGN à tumorigénese, ao serem bastante mais resistentes à progressão dos tumores para estadios mais agressivos. Verificou-se uma muito menor percentagem de tumores do tipo invasivo nos animais transgénicos (3.8 % vs 45.8 % nos Wt). Para além disso, foi observado um aumento da atividade proliferativa nos tumores não-invasivos nos Wt comparativamente aos animais TG-RGN, o que indica a menor capacidade invasiva. A avaliação metabólica dos tumores benignos da glândula demonstrou que os tumores de ratos Tg-RGN possuem uma menor expressão e atividade da lactato desidrogenase (LDH), característica que normalmente se encontra associada a uma restrição da progressão tumoral e a um decréscimo da agressividade. Contudo, em tecido mamário não-neoplásico de ratos Tg-RGN observou-se uma restrição do metabolismo glicolítico, o que é indicativo de uma redução dos níveis energéticos no tecido. Estes resultados podem ser de extrema importância para a diminuição da proliferação celular e constituir um mecanismo adicional, pelo qual a RGN previne o desenvolvimento tumoral. De facto, a sobreexpressão da RGN originou uma diminuição da expressão de genes envolvidos na regulação ciclo celular e de oncogenes na glândula mamária de ratos Tg-RGN. Mais ainda, a expressão do P53 e a atividade da caspase-3 também foi encontrada aumentadas concomitantemente com a sobreexpressão da RGN, o que sugere uma ação protetora da RGN no aparecimento do tumor, a qual pode ser mediada também pela regulação das vias apoptóticas. Em contrapartida, a expressão da RGN em células MCF-7 de cancro da mama diminui pela ação do androgénio não-aromatizável 5α-dihidrotestosterona, ao passo que a expressão do canal de Ca2+ do tipo L aumentou. Estes resultados sustentam a diminuição da viabilidade celular evidenciada nestas células e sugerem o envolvimento destes modeladores do Ca2+ no controlo da proliferação celular mamária, o que no caso do canal de Ca2+ do tipo L nunca antes tinha sido sugerido. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta tese destaca a preponderância da RGN numa diversidade de mecanismos fisiológicos e fisiopatológicos na glândula mamária. As evidências biológicas aqui apresentadas confirmam o papel protetor da RGN na carcinogénese mamária, ao restringir processos biológicos reconhecidos como fundamentais para o desenvolvimento do cancro, nomeadamente, a proliferação celular e as alterações no metabolismo celular, ao mesmo tempo que aumenta a morte celular por apoptose.
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  • Production of new 3D scaffolds for bone tissue regeneration by rapid prototyping
    Publication . Fradique, Ricardo Gil; Correia, Tiago R.; Miguel, Sónia P.; Sá, Kevin; Figueira, Daniela Sofia Rodrigues; Mendonça, António; Correia, Ilídio Joaquim Sobreira
    The incidence of bone disorders, whether due to trauma or pathology, has been trending upward with the aging of the worldwide population. The currently available treatments for bone injuries are rather limited, involving mainly bone grafts and implants. A particularly promising approach for bone regeneration uses rapid prototyping (RP) technologies to produce 3D scaffolds with highly controlled structure and orientation, based on computer-aided design models or medical data. Herein, tricalcium phosphate (TCP)/alginate scaffolds were produced using RP and subsequently their physicochemical, mechanical and biological properties were characterized. The results showed that 60/40 of TCP and alginate formulation was able to match the compression and present a similar Young modulus to that of trabecular bone while presenting an adequate biocompatibility. Moreover, the biomineralization ability, roughness and macro and microporosity of scaffolds allowed cell anchoring and proliferation at their surface, as well as cell migration to its interior, processes that are fundamental for osteointegration and bone regeneration.
    2016-02-17Journal article Restricted access Show more