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Authors
Abstract(s)
O vírus influenza é responsável por uma infeção muito contagiosa que afeta o sistema
respiratório, convencionalmente designada por Gripe. Este vírus é constituído por uma cadeia
simples de RNA “negative sense” pertencente à família Orthomyxoviridae. O vírus influenza
apresenta vários antigénios de superfície como a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA).
A HA é o glicopéptido responsável pela entrada do vírus nas células do hospedeiro e tem
correlação direta com a proteção contra o vírus, uma vez que induz a produção de anticorpos
neutralizantes. Vários estudos têm demonstrado que o insert HA contido nas vacinas de DNA
usadas esperimentalmente permitem conferir protecção cruzada contra várias estirpes do vírus,
o que justifica a sua escolha para este projecto. Por outro lado, a NA é responsável pela saída
do vírus da célula infetada permitimdo a sua propagação. É de referir ainda a proteína M2, um
canal proteico transmembranar responsável pela replicação do vírus.
Segundo dados da organização mundial de saúde em dezembro de 2015, as infeções
respiratórias são mais frequentemente causadas por influenza do tipo A e B, sendo que a
elevada propagação do vírus pelos vários continentes contribui para a ocorrência de mutações
e aparecimento de novas estirpes. Assim, todos os anos vários milhares de pessoas são
hospitalizadas devido a complicações da gripe, havendo uma taxa de mortalidade considerável,
em especial em indivíduos com idade superior a 65 anos e com patologias preexistentes. Deste
modo, a prevenção passa pelo reforço anual do sistema imunitário o que é conseguido de forma
mais rápida e efetiva mediante a aplicação de vacinas. O objetivo da vacinação é controlar ou
diminuir os sinais de infeção e é especialmente importante para indivíduos de elevado risco.
As vacinas convencionais contra influenza são preparadas sazonalmente e são específicas para
uma determinada estirpe, ou seja, a imunidade gerada não é particularmente ampla e a sua
eficácia depende do grau de correspondência entre a vacina e a estirpe circulante. Como
alternativa, a utilização do DNA plasmídico (pDNA) como uma vacina não viral tem-se tornado
numa potencial estratégia terapêutica para prevenir ou tratar determinadas doenças de forma
menos invasiva e segura comparando com os vetores virais.
A vacinação de DNA consiste na injecção de DNA bacteriano geneticamente modificado com o
gene de interesse que expressa proteínas antigénicas responsáveis por desencadear uma
resposta imunológica, evitando a progressão da doença. Estas vacinas oferecem uma série de
vantagens quando comparadas às vacinas clássicas, em termos económicos e técnicos. O
controlo de qualidade é mais fácil e a comercialização não necessita de uma rede de
refrigeração, pois estas vacinas são estáveis à temperatura ambiente e podem ser liofilizadas.
Além disso, as vacinas de DNA induzem uma resposta imunitária celular através da produção
de linfócitos T auxiliares (CD4+) e linfócitos T citotóxicos (CD8+) e também uma resposta
humoral por produção de linfócitos B.
O pDNA usado na produção de vacinas deve conter vários elementos funcionais para garantir a
sua propagação (origem de replicação procariótica) e seleção em microrganismo bacterianos (marcador de seleção, como por exemplo a resistência a um antibiótico). Adicionalmente, deve
apresentar elementos responsáveis por uma elevada expressão nos hospedeiros eucarióticos
(promotor de expressão eurariótica, sinal de poliadenilação, sítio de múltipla clonagem) e
ativação do sistema imunitário (gene de interesse). O pDNA para fins terapêuticos deve estar
em conformidade com as especificações das agências reguladoras, seguindo rigorosos critérios
de qualidade em termos de uso de reagentes tóxicos ou de origem animal, bem como de pureza
relativamente aos restantes constituintes dos lisados celulares. Contudo, as semelhanças
existentes entre o pDNA e os seus contaminantes comuns, como proteínas, endotoxinas, DNA
genómico e RNA, podem complicar a sua separação, pelo que o processo de purificação deverá
ser extremamente eficiente. Portanto a preparação destas vacinas de DNA requer o
desenvolvimento de processos de produção e purificação que permitam obter grandes
quantidades de plasmídeo na sua forma mais compacta e biologicamente ativa (isoforma
superenrolada (sc)).
Hoje em dia qualquer processo para obtenção de vacinas de DNA requer a utilização de métodos
cromatográficos para obtenção do plasmídeo sc na sua forma mais pura. A cromatografia é uma
técnica quantitativa que tem por finalidade geral a identificação e a separação dos
componentes de uma mistura. Os compostos presentes são distribuídos entre uma fase
estacionária e uma fase móvel e a separação ocorre porque os compostos têm diferentes
afinidades com a fase estacionária e com a fase móvel, portanto deslocam-se com diferentes
velocidades. Os métodos cromatográficos exploram propriedades do pDNA como tamanho,
hidrofobicidade, carga e a afinidade das suas bases para os ligandos, de modo a promover a
separação das impurezas com a maior eficiência possível. A flexibilidade deste tipo de processo
advém da grande variedade de suportes e ligandos que podem ser usados, tendo em conta as
características da molécula a separar.
Em relação aos suportes cromatográficas existentes, alguns problemas ainda precisam de ser
ultrapassados, como a baixa capacidade de ligação dos suportes, o tempo do processo de
purificação das biomoléculas e os rendimentos de recuperação. Apesar dos bons resultados
obtidos com as matrizes convencionais há necessidade de utilizar novas matrizes com melhor
performance. Os monolitos poderão ser uma alternativas às matrizes convencionais uma vez
que mostram várias vantagens em relação a estas, nomeadamente: elevada capacidade de
ligação devido às excelentes propriedades de transferência de massa; separação mais rápida o
que leva a uma baixa degradação; resolução independente do caudal; fácil manuseamento e
elevada reprodutibilidade. Desta forma, o trabalho apresentado nesta tese consistiu na
utilização de colunas monolíticas com a finalidade de purificar a isoforma sc da vacina de DNA
NTC 7482-41H-VA2 HA com 6.471kbp que contém o codão de iniciação e sequência necessária
para expressar a HA do vírus influenza.
Numa fase inicial, foram realizados vários ensaios com plasmídeos modelo de diferentes
tamanhos (até 14 kbp) utilizando o monolito CarbonylDiImidazole (CDI) não derivatizado. Este
ligando foi escolhido pelas suas semelhanças com a coluna histidina agarose previamente
utilizada com sucesso na purificação de um plasmideo modelo. Plasmídeos maiores necessitaram de menor concentração de sal (sulfato de amónio) para ligar ao monolito devido
ao maior número de interações entre estas biomoléculas e o monolito. A caracterização do
suporte foi possível através da determinação da capacidade dinámica de ligação (DBC) por
variação de parâmetros como o tamanho do plasmídeo, força iónica, caudal e o pH da fase
móvel. Verificou-se que quanto maior concentração de sal usada, menor a repulsão
electrostática dos grupos fosfato no pDNA, o que torna estas moléculas mais compactas
aumentando a DBC. Por outro lado, observou-se que para o mesmo caudal, plasmídeos maiores
possuem menor DBC, uma vez que ocupam maior área de superfície dentro dos canais do
monolito. Por fim, constatou-se que a diminuição do pH também tem uma influência positiva
na DBC.
No seguimento do trabalho, foi também testado um supporte monolítico imobilizado com
agmatina para a purificação da vacina de pDNA contra o vírus influenza. A agmatina é
naturalmente sintetizada a partir do aminoácido arginina na forma descarboxilada, e é
conhecida pela sua intervenção em inúmeros processos biológicos. As semelhanças estruturais
da agmatina com o seu precursor arginina, previamente utilizado como ligando numa coluna de
agarose para purificar sc pDNA, foram a razão de escolha para o propósito aqui referido. A
agmatina foi pela primeira vez usada como ligando em processos cromatográficos, verificandose
que possui a particularidade de funcionar sob dois modos de interação, o que permitiu a
aplicação de duas estratégias de purificação: gradiente por diminuição da concentração de
sulfato de amónio ou por aumento da concentração de cloreto de sódio. Os melhores resultados
foram obtidos com a estratégia que usa sulfato de amónio, atingindo-se um grau de pureza de
98 % e um rendimento de 51,8 %. Adicionalmente, o método apresentou uma elevada DBC (5.656
mg/mL) e uma redução significativa das impurezas do hospedeiro quando comparadas com o
lisado injectado no monolito. A eficiência de transfeção nos fibroblastos transfectados com o
pDNA sc purificado com esta estratégia foi de 73 %.
Por último, a implementação de uma abordagem baseada em cromatografia de troca iónica
utilizando o monolito com o ligando etilenodiamina (EDA) para a purificação do pDNA sc com
expressão do gene HA do vírus influenza foi também bem sucedida. Este último ligando funciona
por troca aniónica e possui semelhanças estruturais com o ligando DEAE, previamente utilizado
como método analítico para quantificação de impurezas e da isoforma sc em amostras de pDNA.
O processo permitiu uma redução significativa das impurezas provenientes do hospedeiro E.
coli obtendo-se um grau de pureza de 97,1% e um redimento de 47%. Após a verificação dos
padrões de qualidade do pDNA sc purificado, foram realizados ensaios in vitro com 2 tipos de
células (A549 e CHO). A expressão da HA determinada por imunofluorescência permitiu verificar
uma maior eficiência de transfecção nas células CHO com cerca de 70,6 %, enquanto as células
A549 apenas registaram uma eficiência de transfecção de 61,4 %. De entre todos os métodos
cromatográficos utilizados, o EDA permitiu obter um processo mais rápido e com menor impacto
económico.
No global, este projeto de doutoramento demonstrou que os monolitos possuem um grande
potencial de aplicação em processos cromatográficos para a purificação de vacinas de DNA obtidas a partir de lisados complexos de E. coli seguindo as exigências das agências reguladoras.
Apesar de os monolitos utilizados com os ligandos acima referidos apresentarem valores de
rendimento e purificação relativamente semelhantes às matrizes particuladas convencionais, a
elevada capacidade dos monolitos permite uma maior rapidez e eficiência do processo de
purificação.
Influenza viruses (of the Orthomyx-oviridae family) are enveloped, negative-stranded, RNA viruses with segmented genomes responsible for a significant human respiratory disease named flu. Researchers have made efforts to fight this contagious disease that still shows high levels of morbidity and mortality. The best option for reducing the impact of this viral infection is through vaccination. Even though traditional influenza vaccines are safe and usually effective, they only provide protection against the dominant strains of a given year, and thus need to be annually updated. This limitation, together with the use of embryonated chicken eggs as the substrate for vaccine production, is time-consuming and could involve potential biohazards in the growth of new strains of the virus. In the last years, the expansion of efficient plasmid DNA purification processes has fostered new therapeutic applications, concretely gene therapy and DNA vaccination. The latter is a promising alternative to conventional vaccination since it induces all three arms of adaptative immunity (antibodies, helper T cells, cytolytic Tlymphocytes), providing cross-strain protection. Moreover, DNA vaccines need to be obtained in high quantities, can be easily stored and the production process is generic, in contrast to the complicated process needed for conventional vaccines. However, there are still bottlenecks in the large scale manufacturing of this and other DNA pharmaceuticals, mainly at downstream processing level. It is known that a large quantity of the highly pure biologically active supercoiled (sc) plasmid DNA (pDNA) with pharmaceutical grade is necessary to implement this technology. For that purpose, the application of chromatographic operations has demonstrated good results since there are simple, robust, versatile and high reproducible. However, there are still some bottlenecks associated with conventional matrices namely their low binding capacity and diffusivity for pDNA samples. Owing to these limitations, monolithic supports have emerged as interesting alternatives due to the versatility of their structural characteristics, high binding capacity and the excellent transfer mass properties. Thus, in the present project it is proposed the production and purification of pDNA NTC 7482-41H-VA2 HA with 6.471kbp expressing the influenza virus protein hemagglutinin (HA) with new and more efficient processes based on monolithic supports. With these in mind, the non-grafted CarbonylDiImidazole (CDI) monolithic column was explored in order to study the interaction behavior of different plasmids with different sizes. The biorecognition of the intact and undamaged plasmid form, the supercoiled (sc) isoform, was studied on each plasmid with different sizes (at least up to 14 kbp). The characterization of the monolithic support was also evaluated by dynamic binding capacity (DBC) manipulating different salt concentration, flow rates and pH values. The strategy applied in this work showed that the isoforms of plasmids with different sizes can be separated using the CDI monolithic disk. These results showed that it was possible to have a selective separation of the sc isoforms of different plasmids. Higher size plasmids needed a lower ammonium sulphate concentration to bind to the monolith. On the other hand, capacity studies proved that at the same flow rate, the largest plasmid seems to have a lower capacity value whereas the smallest plasmid showed the best capacity value. In addition, high salt concentrations increase the DBC. Finally, the effect of diminishing the pH also had a positive consequence in the breakthrough experiments. These results were useful for the implementation of a new chromatographic strategy based on monolithic supports. An agmatine monolithic disk was also tested in the purification of the sc isoform of a pDNAbased vaccine against influenza. This was the first application of agmatine (decarboxylated arginine) as ligand in a chromatographic process. Due to the role of this molecule in biological processes different interactions between the ligand and other biomolecules of interest can be exploited. Accordingly, two different purification strategies were used by applying either a descending ammonium sulphate or an ascending sodium chloride elution gradient. The best strategy was obtained using ammonium sulphate with a purification degree over 98 % and a recovery yield of 51.8 %. Moreover, this method presented a high binding capacity (5.656 mg/mL) and all the host impurities were significantly reduced or undetectable when compared with the injected lysate. Furthermore, the transfection efficiency of fibroblast cells using the sc pDNA purified with this strategy was also high, reaching an efficiency of 73%. All these results proved that this agmatine-functionalized monolith is a versatile column for pDNA purification. Additionally, an ion exchange interaction chromatography approach using an ethylenediamine (EDA) monolith for the purification of a sc pDNA expressing the influenza virus HA protein was successful. The applied process exhibited a significant reduction of the E. coli host impurities while achieving a sc pDNA purity degree of 97.1 % and a step yield of 47 %. Finally in vitro experiments using A549 and CHO cells were performed. A strong intracellular fluorescence was observed in the transfected CHO cells with the purified sc isoform, presenting 70.6% of transfection while A549 cells showed a weaker signal for a transfection efficiency of 61.4%. The HA expression was recognized by a mouse monoclonal antibody directed to the HA protein with high viability and high transfection efficiency. Overall, this doctoral research work revealed that monoliths have the potential to be further applied in chromatographic processes for purification of a pDNA influenza vaccine from complex lysates under the requirements of the regulatory agencies.
Influenza viruses (of the Orthomyx-oviridae family) are enveloped, negative-stranded, RNA viruses with segmented genomes responsible for a significant human respiratory disease named flu. Researchers have made efforts to fight this contagious disease that still shows high levels of morbidity and mortality. The best option for reducing the impact of this viral infection is through vaccination. Even though traditional influenza vaccines are safe and usually effective, they only provide protection against the dominant strains of a given year, and thus need to be annually updated. This limitation, together with the use of embryonated chicken eggs as the substrate for vaccine production, is time-consuming and could involve potential biohazards in the growth of new strains of the virus. In the last years, the expansion of efficient plasmid DNA purification processes has fostered new therapeutic applications, concretely gene therapy and DNA vaccination. The latter is a promising alternative to conventional vaccination since it induces all three arms of adaptative immunity (antibodies, helper T cells, cytolytic Tlymphocytes), providing cross-strain protection. Moreover, DNA vaccines need to be obtained in high quantities, can be easily stored and the production process is generic, in contrast to the complicated process needed for conventional vaccines. However, there are still bottlenecks in the large scale manufacturing of this and other DNA pharmaceuticals, mainly at downstream processing level. It is known that a large quantity of the highly pure biologically active supercoiled (sc) plasmid DNA (pDNA) with pharmaceutical grade is necessary to implement this technology. For that purpose, the application of chromatographic operations has demonstrated good results since there are simple, robust, versatile and high reproducible. However, there are still some bottlenecks associated with conventional matrices namely their low binding capacity and diffusivity for pDNA samples. Owing to these limitations, monolithic supports have emerged as interesting alternatives due to the versatility of their structural characteristics, high binding capacity and the excellent transfer mass properties. Thus, in the present project it is proposed the production and purification of pDNA NTC 7482-41H-VA2 HA with 6.471kbp expressing the influenza virus protein hemagglutinin (HA) with new and more efficient processes based on monolithic supports. With these in mind, the non-grafted CarbonylDiImidazole (CDI) monolithic column was explored in order to study the interaction behavior of different plasmids with different sizes. The biorecognition of the intact and undamaged plasmid form, the supercoiled (sc) isoform, was studied on each plasmid with different sizes (at least up to 14 kbp). The characterization of the monolithic support was also evaluated by dynamic binding capacity (DBC) manipulating different salt concentration, flow rates and pH values. The strategy applied in this work showed that the isoforms of plasmids with different sizes can be separated using the CDI monolithic disk. These results showed that it was possible to have a selective separation of the sc isoforms of different plasmids. Higher size plasmids needed a lower ammonium sulphate concentration to bind to the monolith. On the other hand, capacity studies proved that at the same flow rate, the largest plasmid seems to have a lower capacity value whereas the smallest plasmid showed the best capacity value. In addition, high salt concentrations increase the DBC. Finally, the effect of diminishing the pH also had a positive consequence in the breakthrough experiments. These results were useful for the implementation of a new chromatographic strategy based on monolithic supports. An agmatine monolithic disk was also tested in the purification of the sc isoform of a pDNAbased vaccine against influenza. This was the first application of agmatine (decarboxylated arginine) as ligand in a chromatographic process. Due to the role of this molecule in biological processes different interactions between the ligand and other biomolecules of interest can be exploited. Accordingly, two different purification strategies were used by applying either a descending ammonium sulphate or an ascending sodium chloride elution gradient. The best strategy was obtained using ammonium sulphate with a purification degree over 98 % and a recovery yield of 51.8 %. Moreover, this method presented a high binding capacity (5.656 mg/mL) and all the host impurities were significantly reduced or undetectable when compared with the injected lysate. Furthermore, the transfection efficiency of fibroblast cells using the sc pDNA purified with this strategy was also high, reaching an efficiency of 73%. All these results proved that this agmatine-functionalized monolith is a versatile column for pDNA purification. Additionally, an ion exchange interaction chromatography approach using an ethylenediamine (EDA) monolith for the purification of a sc pDNA expressing the influenza virus HA protein was successful. The applied process exhibited a significant reduction of the E. coli host impurities while achieving a sc pDNA purity degree of 97.1 % and a step yield of 47 %. Finally in vitro experiments using A549 and CHO cells were performed. A strong intracellular fluorescence was observed in the transfected CHO cells with the purified sc isoform, presenting 70.6% of transfection while A549 cells showed a weaker signal for a transfection efficiency of 61.4%. The HA expression was recognized by a mouse monoclonal antibody directed to the HA protein with high viability and high transfection efficiency. Overall, this doctoral research work revealed that monoliths have the potential to be further applied in chromatographic processes for purification of a pDNA influenza vaccine from complex lysates under the requirements of the regulatory agencies.
Description
Keywords
Agmatina CDI Capacidade dinâmica de ligação Cromatografia Influenza DNA plasmídico superenrolado Monolito Transfecção Vacina de DNA DNA vaccine Chromatography Dynamic binding capacity Monolith Transfection