AMINO ACID DERIVATIZED MONOLITHS FOR PURIFICATION OF A DNA VACCINE AGAINST INFLUENZA

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Monoliths for purification of a DNA vaccine against Influenza

Publication . Bicho, Diana Stefanía Faria; Tomaz, Cândida Ascensão Teixeira; Queiroz, João António de Sampaio Rodrigues

O vírus influenza é responsável por uma infeção muito contagiosa que afeta o sistema respiratório, convencionalmente designada por Gripe. Este vírus é constituído por uma cadeia simples de RNA “negative sense” pertencente à família Orthomyxoviridae. O vírus influenza apresenta vários antigénios de superfície como a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA). A HA é o glicopéptido responsável pela entrada do vírus nas células do hospedeiro e tem correlação direta com a proteção contra o vírus, uma vez que induz a produção de anticorpos neutralizantes. Vários estudos têm demonstrado que o insert HA contido nas vacinas de DNA usadas esperimentalmente permitem conferir protecção cruzada contra várias estirpes do vírus, o que justifica a sua escolha para este projecto. Por outro lado, a NA é responsável pela saída do vírus da célula infetada permitimdo a sua propagação. É de referir ainda a proteína M2, um canal proteico transmembranar responsável pela replicação do vírus. Segundo dados da organização mundial de saúde em dezembro de 2015, as infeções respiratórias são mais frequentemente causadas por influenza do tipo A e B, sendo que a elevada propagação do vírus pelos vários continentes contribui para a ocorrência de mutações e aparecimento de novas estirpes. Assim, todos os anos vários milhares de pessoas são hospitalizadas devido a complicações da gripe, havendo uma taxa de mortalidade considerável, em especial em indivíduos com idade superior a 65 anos e com patologias preexistentes. Deste modo, a prevenção passa pelo reforço anual do sistema imunitário o que é conseguido de forma mais rápida e efetiva mediante a aplicação de vacinas. O objetivo da vacinação é controlar ou diminuir os sinais de infeção e é especialmente importante para indivíduos de elevado risco. As vacinas convencionais contra influenza são preparadas sazonalmente e são específicas para uma determinada estirpe, ou seja, a imunidade gerada não é particularmente ampla e a sua eficácia depende do grau de correspondência entre a vacina e a estirpe circulante. Como alternativa, a utilização do DNA plasmídico (pDNA) como uma vacina não viral tem-se tornado numa potencial estratégia terapêutica para prevenir ou tratar determinadas doenças de forma menos invasiva e segura comparando com os vetores virais. A vacinação de DNA consiste na injecção de DNA bacteriano geneticamente modificado com o gene de interesse que expressa proteínas antigénicas responsáveis por desencadear uma resposta imunológica, evitando a progressão da doença. Estas vacinas oferecem uma série de vantagens quando comparadas às vacinas clássicas, em termos económicos e técnicos. O controlo de qualidade é mais fácil e a comercialização não necessita de uma rede de refrigeração, pois estas vacinas são estáveis à temperatura ambiente e podem ser liofilizadas. Além disso, as vacinas de DNA induzem uma resposta imunitária celular através da produção de linfócitos T auxiliares (CD4+) e linfócitos T citotóxicos (CD8+) e também uma resposta humoral por produção de linfócitos B. O pDNA usado na produção de vacinas deve conter vários elementos funcionais para garantir a sua propagação (origem de replicação procariótica) e seleção em microrganismo bacterianos (marcador de seleção, como por exemplo a resistência a um antibiótico). Adicionalmente, deve apresentar elementos responsáveis por uma elevada expressão nos hospedeiros eucarióticos (promotor de expressão eurariótica, sinal de poliadenilação, sítio de múltipla clonagem) e ativação do sistema imunitário (gene de interesse). O pDNA para fins terapêuticos deve estar em conformidade com as especificações das agências reguladoras, seguindo rigorosos critérios de qualidade em termos de uso de reagentes tóxicos ou de origem animal, bem como de pureza relativamente aos restantes constituintes dos lisados celulares. Contudo, as semelhanças existentes entre o pDNA e os seus contaminantes comuns, como proteínas, endotoxinas, DNA genómico e RNA, podem complicar a sua separação, pelo que o processo de purificação deverá ser extremamente eficiente. Portanto a preparação destas vacinas de DNA requer o desenvolvimento de processos de produção e purificação que permitam obter grandes quantidades de plasmídeo na sua forma mais compacta e biologicamente ativa (isoforma superenrolada (sc)). Hoje em dia qualquer processo para obtenção de vacinas de DNA requer a utilização de métodos cromatográficos para obtenção do plasmídeo sc na sua forma mais pura. A cromatografia é uma técnica quantitativa que tem por finalidade geral a identificação e a separação dos componentes de uma mistura. Os compostos presentes são distribuídos entre uma fase estacionária e uma fase móvel e a separação ocorre porque os compostos têm diferentes afinidades com a fase estacionária e com a fase móvel, portanto deslocam-se com diferentes velocidades. Os métodos cromatográficos exploram propriedades do pDNA como tamanho, hidrofobicidade, carga e a afinidade das suas bases para os ligandos, de modo a promover a separação das impurezas com a maior eficiência possível. A flexibilidade deste tipo de processo advém da grande variedade de suportes e ligandos que podem ser usados, tendo em conta as características da molécula a separar. Em relação aos suportes cromatográficas existentes, alguns problemas ainda precisam de ser ultrapassados, como a baixa capacidade de ligação dos suportes, o tempo do processo de purificação das biomoléculas e os rendimentos de recuperação. Apesar dos bons resultados obtidos com as matrizes convencionais há necessidade de utilizar novas matrizes com melhor performance. Os monolitos poderão ser uma alternativas às matrizes convencionais uma vez que mostram várias vantagens em relação a estas, nomeadamente: elevada capacidade de ligação devido às excelentes propriedades de transferência de massa; separação mais rápida o que leva a uma baixa degradação; resolução independente do caudal; fácil manuseamento e elevada reprodutibilidade. Desta forma, o trabalho apresentado nesta tese consistiu na utilização de colunas monolíticas com a finalidade de purificar a isoforma sc da vacina de DNA NTC 7482-41H-VA2 HA com 6.471kbp que contém o codão de iniciação e sequência necessária para expressar a HA do vírus influenza. Numa fase inicial, foram realizados vários ensaios com plasmídeos modelo de diferentes tamanhos (até 14 kbp) utilizando o monolito CarbonylDiImidazole (CDI) não derivatizado. Este ligando foi escolhido pelas suas semelhanças com a coluna histidina agarose previamente utilizada com sucesso na purificação de um plasmideo modelo. Plasmídeos maiores necessitaram de menor concentração de sal (sulfato de amónio) para ligar ao monolito devido ao maior número de interações entre estas biomoléculas e o monolito. A caracterização do suporte foi possível através da determinação da capacidade dinámica de ligação (DBC) por variação de parâmetros como o tamanho do plasmídeo, força iónica, caudal e o pH da fase móvel. Verificou-se que quanto maior concentração de sal usada, menor a repulsão electrostática dos grupos fosfato no pDNA, o que torna estas moléculas mais compactas aumentando a DBC. Por outro lado, observou-se que para o mesmo caudal, plasmídeos maiores possuem menor DBC, uma vez que ocupam maior área de superfície dentro dos canais do monolito. Por fim, constatou-se que a diminuição do pH também tem uma influência positiva na DBC. No seguimento do trabalho, foi também testado um supporte monolítico imobilizado com agmatina para a purificação da vacina de pDNA contra o vírus influenza. A agmatina é naturalmente sintetizada a partir do aminoácido arginina na forma descarboxilada, e é conhecida pela sua intervenção em inúmeros processos biológicos. As semelhanças estruturais da agmatina com o seu precursor arginina, previamente utilizado como ligando numa coluna de agarose para purificar sc pDNA, foram a razão de escolha para o propósito aqui referido. A agmatina foi pela primeira vez usada como ligando em processos cromatográficos, verificandose que possui a particularidade de funcionar sob dois modos de interação, o que permitiu a aplicação de duas estratégias de purificação: gradiente por diminuição da concentração de sulfato de amónio ou por aumento da concentração de cloreto de sódio. Os melhores resultados foram obtidos com a estratégia que usa sulfato de amónio, atingindo-se um grau de pureza de 98 % e um rendimento de 51,8 %. Adicionalmente, o método apresentou uma elevada DBC (5.656 mg/mL) e uma redução significativa das impurezas do hospedeiro quando comparadas com o lisado injectado no monolito. A eficiência de transfeção nos fibroblastos transfectados com o pDNA sc purificado com esta estratégia foi de 73 %. Por último, a implementação de uma abordagem baseada em cromatografia de troca iónica utilizando o monolito com o ligando etilenodiamina (EDA) para a purificação do pDNA sc com expressão do gene HA do vírus influenza foi também bem sucedida. Este último ligando funciona por troca aniónica e possui semelhanças estruturais com o ligando DEAE, previamente utilizado como método analítico para quantificação de impurezas e da isoforma sc em amostras de pDNA. O processo permitiu uma redução significativa das impurezas provenientes do hospedeiro E. coli obtendo-se um grau de pureza de 97,1% e um redimento de 47%. Após a verificação dos padrões de qualidade do pDNA sc purificado, foram realizados ensaios in vitro com 2 tipos de células (A549 e CHO). A expressão da HA determinada por imunofluorescência permitiu verificar uma maior eficiência de transfecção nas células CHO com cerca de 70,6 %, enquanto as células A549 apenas registaram uma eficiência de transfecção de 61,4 %. De entre todos os métodos cromatográficos utilizados, o EDA permitiu obter um processo mais rápido e com menor impacto económico. No global, este projeto de doutoramento demonstrou que os monolitos possuem um grande potencial de aplicação em processos cromatográficos para a purificação de vacinas de DNA obtidas a partir de lisados complexos de E. coli seguindo as exigências das agências reguladoras. Apesar de os monolitos utilizados com os ligandos acima referidos apresentarem valores de rendimento e purificação relativamente semelhantes às matrizes particuladas convencionais, a elevada capacidade dos monolitos permite uma maior rapidez e eficiência do processo de purificação.

2016-02Doctoral thesis

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