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- Further insights into regucalcin actions as a potential tumour suppressor in human prostatePublication . Fonseca, Lara Raquel dos Santos; Socorro, Sílvia Cristina da Cruz Marques; Vaz, Cátia Alexandra Vicente; Cardoso, Henrique José Matos Morão MingoteThe calcium-binding protein regucalcin (RGN) regulates several biological processes, namely the hallmarks of cancer, such as cell proliferation and apoptosis. Previous work of our research group reported that the loss of RGN expression accompanies the onset and progression of prostate cancer (PCa). However, it remains largely unknown if the decrease of RGN expression is a cause or consequence of PCa. The present thesis aims to investigate the relationship of RGN expression levels with the hallmarks of cancer and PCa patients’ outcomes. An in silico analysis using the CancerTool3 software and patients’ datasets demonstrated that the loss of RGN correlates with the onset and progression of PCa to metastatic forms of disease. However, no correlation was found between the expression levels of RGN and the histological score of Gleason or PCa recurrence. Moreover, it was found that PCa patients with higher RGN expression levels displayed higher disease-free survival. Bioinformatic analysis of gene-to-gene expression correlation showed that the RGN gene expression in primary prostate tumours correlates directly with the expression of cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (CDKN1A) and IL6 genes. CDKN1A gene encodes the cell cycle inhibitor p21, which has been indicated as a target of RGN in rat prostate and human cancers. No other previous study has identified a connection of RGN with IL-6 in cancer cells or tissues. Secondly, we investigated whether the loss of RGN expression may alter human prostate cell fate. Using a siRNA gene silencing approach, RGN gene expression in human non-neoplastic PNT1A cells was knockdown (KD), which was confirmed by quantitative real-time PCR. RGN gene KD increased the viability and proliferative ability of PNT1A cells as indicated by the MTT and sulforhodamine B assays’ results, and the fluorescent immunocytochemistry of the Ki-67 proliferation marker. The reduced caspase-3-like activity found in PNT1A cells KD for RGN demonstrated that the loss of this protein might contribute to apoptosis resistance. Western Blot results showed that the changes in prostate cell fate were accompanied by the altered expression of oncoproteins, such as AKT and its phosphorylated form, as well as c-myc; and also key regulators of the extrinsic pathway of apoptosis, namely, FasR, FasL and caspase-8. RGN gene KD did not alter the glycolytic metabolism of PNT1A cells, as indicated by the results of glucose consumption and lactate production. Altogether, the present findings showed that the loss of RGN expression alters the behaviour of human prostate cells and promotes the aggressiveness and progression of PCa, which supports the RGN’s role as a tumour suppressor protein. Moreover, the obtained results also support the idea that maintaining high RGN expression levels may prevent the prostate carcinogenic process and delay the progression of the disease.
- Aplicação de metodologia Next Generation Sequencing na pesquisa de determinantes genéticos da febre Q crónica na via de sinalização IL12-IFNyPublication . Gaspar, Ulisses Emanuel Rodrigues; David, Susana Correia de Matos; Pereira, Maria Petronila Jorge Frade RochaA febre Q é uma zoonose causada por Coxiella burnetii, na qual cerca de 60% dos doentes apresentam quadros clínicos de infecção aguda, com recuperação após intervenção clínica. No entanto, nos casos de febre Q crónica, a infecção culmina em complicações graves, frequentemente endocardites. Mesmo com medidas preventivas, a incidência da febre Q tem vindo a aumentar, principalmente na Península Ibérica. A fisiopatologia da infecção por C. burnetii assemelha-se à do Mycobacterium tuberculosis. Em ambas as infecções, a via interleucina12—interferão gama (IL12-IFN?) desempenha um papel importante na sobrevivência e replicação intracelular bacteriana. As doenças causadas por micobactérias apresentam homogeneidade fisiológica inerente à deficiência de interferão gama (IFN?), o que é fundamentado pela identificação de determinantes genéticos dessas infecções na via IL12-IFN?. No entanto, esta via permanece praticamente inexplorada em termos de associação genética com a febre Q crónica, enaltecendo a necessidade destes estudos. Assim, nesta investigação procurou-se identificar variantes associadas a febre Q crónica através de uma abordagem por estudos populacionais de associação genótipo fenótipo com base em genes candidatos (Candidate Gene Association Studies - CGAS). Esta abordagem insere-se numa arquitetura de estudo caso-controlo. Selecionaram-se genes candidatos e optou-se pela utilização de uma estratégia de sequenciação de nova geração (Next Generation Sequencing – NGS) para a genotipagem das regiões 5’UTR e os exões dos genes candidatos. Após consentimento informado, foram recrutados 34 indivíduos saudáveis e 60 doentes com febre Q (43 formas agudas e 17 formas crónicas). Os genes do receptor ß1 de interleucina-12 (IL12RB1), receptor 1 de interferão gama (IFN?R1) e receptor 2 de interferão gama (IFN?R2), com fragmentos de 2kb a 17kb, foram amplificados por polimerase de reação em cadeia (PCR) de longo alcance com ácido desoxirribonucleico (ADN) polimerase Takara LA Taq® para construção de bibliotecas Nextera e sequenciação com tecnologia da Illumina®. Uma vez que a NGS trabalha com milhares de milhões de dados em simultâneo requer a aplicação de várias métricas de controlo de qualidade de modo a garantir resultados fidedignos. Para além destas métricas foram ainda implementadas métricas específicas para CGAS que têm por objectivo diminuir a obtenção de erros por falsos positivos na análise estatística. Do presente trabalho de investigação resultou uma lista de polimorfismos de nucleótido único (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) dos genes IL12RB1, IFN?R1 e IFN?R2 em indivíduos com febre Q crónica, aguda e numa amostra de conveniência de indivíduos saudáveis. Estes dados têm a necessária qualidade para constituir uma mais valia, podendo ser aplicados a diferentes estudos. Futuramente, esta lista de SNPs será usada em estudos de associação genótipo-fenótipo para compreender se existem variantes na via IL12-IFN? associadas à apresentação clínica doença. Assim, estes resultados poderão vir a ser um importante avanço clínico não só para antecipar formas crónicas da doença como para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e para prestação de melhores cuidados de saúde a estes doentes.