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- Estudo das condições de purificação de DNA plasmídico na sua atividade biológica em terapia do cancroPublication . Azevedo Junior, Gilson; Queiroz, João António de Sampaio Rodrigues; Sousa, Fani Pereira deExistem mais de 200 tipos de cancro descritos e em mais de 50% dos casos, o gene supressor de tumor TP53 encontra-se mutado. Esta condição promove diferentes alterações aos mecanismos fisiológicos, passando a célula a adquirir auto-suficiência em sinais de crescimento; insensibilidade a sinais de anticrescimento; angiogénese sustentada; capacidade de invasão de tecido e metástase; potencial replicativo ilimitado e evasão de morte celular programada (apoptose). Numa situação normal, a proteína p53 protege as células contra a tumorigénese detetando stresse metabólico ou danos no DNA, e o seu mecanismo de resposta é dependente do tipo de célula e da lesão que está presente. Em resposta ao stresse, a p53 pode levar a célula à senescência, autofagia, paragem do ciclo celular, reparação do DNA e apoptose. Dessa forma, é razoável supor que o reestabelecimento da função da p53 possa controlar a proliferação do cancro. O presente trabalho pretende descrever o efeito que as condições usadas na purificação do pDNA, podem ter na sua estabilidade e atividade. Assim, é apresentada a aplicação de três colunas cromatográficas para purificar a isoforma superenrolada de pcDNA3- FLAG-p53, um plasmídeo terapêutico. A estabilidade e a atividade biológica do plasmídeo foram posteriormente avaliadas por dicroísmo circular, potencial zeta, expressão de proteína e apoptose pelo teste ELISA. Os resultados apresentados mostram que a topologia B do DNA foi mantida nas três amostras purificadas por cromatografia de afinidade e que a maior bioatividade foi verificada para o pDNA purificado através da matriz de arginina macroporosa, seguido por monólito de histidina e histidina agarose. Apesar do grau de pureza de 92% e rendimento de recuperação de 43% do sc pDNA isolado por arginina macroporosa, esta amostra permitiu a obtenção de maiores níveis de expressão da proteína terapêutica e consequentemente maior efeito apoptótico que as outras amostras de pDNA purificado por histidina agarose (grau de pureza de 97% e recuperação de 42%) e monólito de histidina (grau de pureza de 100% e rendimento de recuperação de 72%). Esse comportamento pode estar relacionado com as condições cromatográficas usadas na matriz de arginina macroporosa, nomeadamente a baixa força iónica de NaCl, em tampão de pH neutro e baixas temperaturas, quando comparadas às condições de elevada força iónica, usando (NH4)2SO4 e temperatura ambiente ou pH ácido, aquando da purificação do pDNA com matrizes de histidina.