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Publicação
Affinity chromatography in plasmid DNA purification for therapeutic applications
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Orientador(es)
Resumo(s)
The discovery of disease-related genes and the possibility to manipulate the gene set-up in some organisms has fostered the development of innovative human DNA therapeutics over the last years. Although viral vectors are used in the majority of the trials, non-viral vectors, particularly plasmid DNA (pDNA) vectors, are attracting considerable attention as biotherapeutics both in gene therapy or DNA vaccination, due to their lower immunogenicity, toxicity and also the economic, safer and easier manufacture. Nevertheless, it is well known that the success of gene transfer to cells and subsequent expression is strictly affected by the pDNA manufacturing process. The use of pDNA-based therapeutics relies on procedures that efficiently purify the most biologically active and effective topology, the supercoiled (sc) plasmid conformation. However, chromatographic purification of sc pDNA has specific problems which are mostly related to the structural nature of this biomolecule, the resemblance between pDNA topologies and also with some host impurities, as well as the lack of capacity and selectivity of the traditional bead adsorbents. Recently, sc pDNA purification strategies that use amino acids as immobilized ligands have yielded interesting results. Thus, the present work intends to explore and understand the underlying interactions responsible for the biorecognition of sc conformation by the amino acids ligands already used for pDNA purification as well as to establish the elution conditions that favor the prevalence of some interactions on other. By performing some fundamental studies with oligonucleotides it was observed the involvement of several elementary interactions with the amino acids matrices studied, such as hydrophobic, ring-stacking, cation-π, water-mediated bonds, multiple hydrogen bonds, van der Waals and electrostatic interactions. Although hydrophobic interactions easily appear with histidine matrix or ionic interactions with arginine matrix, it was verified the presence of other interactions in function of the elution conditions used. These results were useful for the implementation of a new affinity chromatographic strategy with the amino acid lysine for efficiently and selectively purify the sc pDNA isoform. Lysineaffinity matrix allowed the elimination of the E. coli impurities as well as other ineffective plasmid isoforms present in a complex clarified lysate meeting all the regulatory requirements. The preferential retention of the nucleic acids with higher bases exposure indicates that this matrix can be more suitable for RNA purification. In accordance with the traditional supports limitations, the alternative monolithic chromatography revealed satisfactory affinity properties with excellent mass transfer and capacity characteritics, allowing a fast and efficient plasmid isoforms separation without flow rate dependence. The similar elution conditions with histidine-agarose and the presence of canbonyldiimidazole groups suggested that the imidazole ring present in this monolithic disk is the major responsible in the specific biorecognition of sc pDNA isoform. Integration of monolithic chromatography in the pDNA manufacturing process also increase the global yield of pDNA xviiirecovery for 89%, with a purity degree according to the recommendations of the regulatory agencies that was reflected in the high transfection efficiency of sc pDNA sample on eukaryotic cells (59% in COS-7 cells). Overall, this doctoral research work revealed that amino acid-based affinity chromatography is a powerful and versatile methodology for nucleic acids purification, mainly the sc pDNA topology, guaranteeing suitable purity degree for DNA-based therapies. Besides the selectivity and specificity obtained with amino acids affinity ligands, the application of the innovative monolithic technology in the pDNA purification field brought a great improvement of the speed, resolution and capacity to the chromatographic performance, being a promising association for plasmid purification technology. Hence, this work provided valuable and helpful information concerning amino acid-affinity chromatography and chromatographic supports that can be useful in the future pDNA bioseparation either for preparative and analytical processes.
A investigação do genoma e proteoma humano tem fornecido informações fundamentais em relação às funções dos genes, assim como ao impacto das mutações desses genes na saúde humana. O conhecimento contínuo e crescente destas áreas tem conduzido à implementação de técnicas efectivas que usam genes como biofármacos para o tratamento de determinadas doenças incuráveis. O desenvolvimento de qualquer estratégia terapêutica baseada na entrega de genes requer uma avaliação precisa de vários parâmetros, incluindo a garantia de que uma dada doença pode ser realmente tratada usando esta estratégia, a escolha e obtenção do gene terapêutico correcto, o controlo da expressão do gene em células de mamíferos e a selecção do sistema de entrega e administração mais adequado. Na verdade, a sequenciação completa do genoma humano combinado com a compreensão das propriedades de vários genes relacionados com determinadas doenças tem posicionado a terapia génica ao nível somático e a vacinação génica entre os processos biotecnológicos mais interessantes. A terapia génica pode ser vista como um sistema de expressão de proteínas específicas usando as células dos próprios pacientes como mini-biorreactores. Esta estratégia terapêutica permite não só repor os genes defeituosos ou inexistentes dentro das células dos pacientes, mas também suplementar o organismo com a produção de proteínas que podem prevenir ou até mesmo tratar a doença alvo. Por outro lado, o desenvolvimento de novas vacinas génicas, que têm a capacidade de induzir respostas imunes anti-patogénicas ou anti-tumorais, tem sido explorado para promover tratamentos profilácticos ou terapêuticos inovadores contra doenças infecciosas e cancro. Assim sendo, a terapia génica e as vacinas de DNA têm evoluído firmemente nos últimos anos, tornando-se numa nova classe terapêutica com potencial para prevenir, corrigir ou modelar doenças adquiridas ou genéticas. Embora os vectores virais sejam usados na maioria dos ensaios clínicos, os vectores não virais, particularmente o vector de DNA plasmídico (pDNA), têm atraído uma atenção considerável como biofármacos quer na terapia génica, quer nas vacinas de DNA, devido à sua baixa toxicidade e imunogenecidade, assim como a sua obtenção segura, fácil e económica. Sabendo que o sucesso da transferência de genes para células eucarióticas e subsequente expressão do gene de interesse contido no pDNA é estritamente afectado pelo processo de obtenção do vector, torna-se essencial o desenvolvimento de novas plataformas que permitam a recuperação simples do vector, com um elevado número de cópias e grau de pureza satisfatório. Na verdade, o pDNA é maioritariamente amplificado no hospedeiro Escherichia coli (E. coli) sob a conformação superenrolada (sc). Uma vez que esta isoforma é a única conformação do pDNA naturalmente intacta e sem danos estruturais, sendo considerada por isso a isoforma mais activa e eficiente na transfecção e expressão de genes em células eucarióticas, torna-se extremamente importante desenvolver estratégias adequadas para o isolamento e purificação desta isoforma do vector plasmídico. Existem várias técnicas que podem ser aplicadas para obter a conformação sc, isolando esta isoforma das topologias não efectivas do plasmídeo, permitindo ainda a eliminação das impurezas do hospedeiro, que caso estejam presentes no produto final em quantidades superiores às recomendadas pelas agências reguladoras podem causar efeitos adversos e respostas inflamatórias nos pacientes. No entanto, o grande desafio para o sucesso destas etapas passa pela dificuldade em diferenciar a isoforma sc das outras topologias do plasmídeo (ao nível estrutural) e das impurezas do hospedeiro que apresentam características comuns, tais como carga negativa (RNA, DNA genómico (gDNA) e endotoxinas), tamanho (gDNA, endotoxinas) e hidrofobicidade (endotoxinas). Comparando as várias estratégias cromatográficas já aplicadas na purificação da isoforma sc do pDNA, algumas delas apresentam mais vantagens do que outras devido à especificidade e selectividade promovidas por determinados suportes, utilizando condições de eluição suaves que evitam a perda de integridade desta biomolécula. Contudo, a cromatografia de afinidade usando aminoácidos como ligandos tem mostrado ser uma técnica adequada para obter a isoforma sc do pDNA de acordo com os critérios das agências reguladoras, eliminando as restantes topologias do plasmídeo e impurezas do hospedeiro num só passo cromatográfico. Assim sendo, o presente trabalho de doutoramento tem como objectivo principal o desenvolvimento e implementação de novas estratégias de cromatografia de afinidade que permitam melhorar e ultrapassar algumas limitações dos processos já desenvolvidos para a obtenção da isoforma sc do pDNA. Inicialmente foram realizados estudos com oligonucleótidos sintéticos para compreender as interacções envolvidas entre os ácidos nucleicos e as matrizes de afinidade, assim como as condições de eluição que favorecem o bioreconhecimento da conformação sc do pDNA pelas matrizes de histidina- e arginina-agarose já usadas na purificação destes vectores. Os resultados obtidos nesses estudos fundamentais mostraram o envolvimento de várias interacções entre os ácidos nucleicos e as matrizes de aminoácidos estudadas, tais como interacções hidrofóbicas, interacções-π, pontes de hidrogénio, pontes mediadas por água, interacções electrostáticas e forças de van der Waals. Embora as interacções hidrofóbicas prevaleçam quando se usa a matriz de histidina e as interacções iónicas com a matriz de arginina, também se observou a presença de outras interacções que se tornaram dominantes em função das condições de eluição usadas, e preponderantes para o reconhecimento específico da isoforma sc. Estes resultados forneceram informações proveitosas para a implementação de novas estratégias cromatográficas de afinidade como por exemplo com a matriz de lisina, que é um aminoácido de constituição semelhante à arginina. A cromatografia de afinidade com lisina resultou na purificação selectiva e eficiente do pDNA, apresentando uma homogeneidade superior a 97% da isoforma sc, e eliminando as impurezas do hospedeiro de E. coli, respeitando os requerimentos das agências reguladoras. O rendimento da recuperação global do pDNA no final desta etapa cromatográfica foi de 55%. No entanto, a eficiência de transfecção de células eucarióticas (COS-7) com a amostra de pDNA sc final foi consideravelmente superior à eficiência obtida com uma amostra de plasmídeo na conformação circular aberta ou relativamente à amostra de pDNA nativo purificada através de um kit comercial. Adicionalmente, foi realizado um estudo comparativo do comportamento de ligação e eluição dos vários ácidos nucleicos injectados individualmente nas três matrizes de aminoácidos anteriormente referidas, sob influência de diferentes condições de temperatura, composição e força iónica do tampão de eluição. As matrizes de histidina e lisina mostraram uma retenção preferencial pelos ácidos nucleicos com maior grau de exposição das bases nucleotídicas como por exemplo o RNA, parecendo que ambas as matrizes são indicadas para utilizar na purificação deste ácido nucleico. Tendo em conta que a matriz de lisina requer condições de eluição suaves, torna-se um método de purificação mais económico do que a histidina-agarose, principalmente para aplicar ao nível industrial. Por outro lado a argininaagarose apresentou uma retenção preferencial pela isoforma sc do plasmídeo em condições cromatográficas suaves tornando-se um suporte adequado à purificação deste vector. Embora as matrizes de afinidade com aminoácidos imobilizados permitam um reconhecimento específico e selectivo pela molécula de interesse, as limitações associadas aos suportes convencionais permanecem por resolver. Assim sendo, foi aplicado um suporte monolítico como uma alternativa cromatográfica para a purificação de pDNA, revelando boas propriedades de selectividade e transferência de massa, assim como elevada capacidade de ligação para o pDNA, permitindo uma rápida e eficiente separação das isoformas independentemente da taxa de fluxo aplicada. Tendo em conta que o monolito utilizado apresenta grupos funcionais de carbonildiimidazole e que as condições de eluição do pDNA são semelhantes às usadas na matriz de histidina-agarose, foi sugerido que o anel de imidazole presente neste disco monolítico é o principal responsável pelo reconhecimento específico da isoforma sc. A integração da cromatografia com monolitos no processo geral de obtenção do plasmídeo puro também resultou num aumento do rendimento global da etapa de recuperação de pDNA para 89%. A amostra final de pDNA sc foi obtida com um elevado grau de pureza, respeitando os critérios das agências reguladoras, que se reflectiu no aumento da eficiência de transfecção de células eucarióticas (59% com a linha celular COS-7). Este suporte monolítico além de evitar a degradação do pDNA devido ao reduzido tempo de contacto, também pode ser aplicado na purificação de plasmídeos com maiores dimensões sem grandes alterações da estratégia de purificação estabelecida. Em conclusão, este projecto de investigação revelou que a cromatografia de afinidade baseada em aminoácidos é uma metodologia poderosa e versátil para a purificação de ácidos nucleicos, especialmente da topologia sc do pDNA, com um elevado grau de pureza, adequado para aplicações terapêuticas baseadas em DNA. Além da selectividade e especificidade obtida com os ligandos de aminoácidos, a aplicação da tecnologia monolítica inovadora na purificação do pDNA forneceu grandes avanços relativamente à velocidade, resolução e capacidade da performance cromatográfica, revelando-se uma associação promissora para a tecnologia de purificação de plasmídeos. Assim, este trabalho reune informações úteis e valiosas relativamente à cromatografia de afinidade baseada em aminoácidos e dos suportes cromatográficos que podem ser aplicáveis futuramente, quer em processos preparativos quer analíticos da bioseparação do pDNA.
A investigação do genoma e proteoma humano tem fornecido informações fundamentais em relação às funções dos genes, assim como ao impacto das mutações desses genes na saúde humana. O conhecimento contínuo e crescente destas áreas tem conduzido à implementação de técnicas efectivas que usam genes como biofármacos para o tratamento de determinadas doenças incuráveis. O desenvolvimento de qualquer estratégia terapêutica baseada na entrega de genes requer uma avaliação precisa de vários parâmetros, incluindo a garantia de que uma dada doença pode ser realmente tratada usando esta estratégia, a escolha e obtenção do gene terapêutico correcto, o controlo da expressão do gene em células de mamíferos e a selecção do sistema de entrega e administração mais adequado. Na verdade, a sequenciação completa do genoma humano combinado com a compreensão das propriedades de vários genes relacionados com determinadas doenças tem posicionado a terapia génica ao nível somático e a vacinação génica entre os processos biotecnológicos mais interessantes. A terapia génica pode ser vista como um sistema de expressão de proteínas específicas usando as células dos próprios pacientes como mini-biorreactores. Esta estratégia terapêutica permite não só repor os genes defeituosos ou inexistentes dentro das células dos pacientes, mas também suplementar o organismo com a produção de proteínas que podem prevenir ou até mesmo tratar a doença alvo. Por outro lado, o desenvolvimento de novas vacinas génicas, que têm a capacidade de induzir respostas imunes anti-patogénicas ou anti-tumorais, tem sido explorado para promover tratamentos profilácticos ou terapêuticos inovadores contra doenças infecciosas e cancro. Assim sendo, a terapia génica e as vacinas de DNA têm evoluído firmemente nos últimos anos, tornando-se numa nova classe terapêutica com potencial para prevenir, corrigir ou modelar doenças adquiridas ou genéticas. Embora os vectores virais sejam usados na maioria dos ensaios clínicos, os vectores não virais, particularmente o vector de DNA plasmídico (pDNA), têm atraído uma atenção considerável como biofármacos quer na terapia génica, quer nas vacinas de DNA, devido à sua baixa toxicidade e imunogenecidade, assim como a sua obtenção segura, fácil e económica. Sabendo que o sucesso da transferência de genes para células eucarióticas e subsequente expressão do gene de interesse contido no pDNA é estritamente afectado pelo processo de obtenção do vector, torna-se essencial o desenvolvimento de novas plataformas que permitam a recuperação simples do vector, com um elevado número de cópias e grau de pureza satisfatório. Na verdade, o pDNA é maioritariamente amplificado no hospedeiro Escherichia coli (E. coli) sob a conformação superenrolada (sc). Uma vez que esta isoforma é a única conformação do pDNA naturalmente intacta e sem danos estruturais, sendo considerada por isso a isoforma mais activa e eficiente na transfecção e expressão de genes em células eucarióticas, torna-se extremamente importante desenvolver estratégias adequadas para o isolamento e purificação desta isoforma do vector plasmídico. Existem várias técnicas que podem ser aplicadas para obter a conformação sc, isolando esta isoforma das topologias não efectivas do plasmídeo, permitindo ainda a eliminação das impurezas do hospedeiro, que caso estejam presentes no produto final em quantidades superiores às recomendadas pelas agências reguladoras podem causar efeitos adversos e respostas inflamatórias nos pacientes. No entanto, o grande desafio para o sucesso destas etapas passa pela dificuldade em diferenciar a isoforma sc das outras topologias do plasmídeo (ao nível estrutural) e das impurezas do hospedeiro que apresentam características comuns, tais como carga negativa (RNA, DNA genómico (gDNA) e endotoxinas), tamanho (gDNA, endotoxinas) e hidrofobicidade (endotoxinas). Comparando as várias estratégias cromatográficas já aplicadas na purificação da isoforma sc do pDNA, algumas delas apresentam mais vantagens do que outras devido à especificidade e selectividade promovidas por determinados suportes, utilizando condições de eluição suaves que evitam a perda de integridade desta biomolécula. Contudo, a cromatografia de afinidade usando aminoácidos como ligandos tem mostrado ser uma técnica adequada para obter a isoforma sc do pDNA de acordo com os critérios das agências reguladoras, eliminando as restantes topologias do plasmídeo e impurezas do hospedeiro num só passo cromatográfico. Assim sendo, o presente trabalho de doutoramento tem como objectivo principal o desenvolvimento e implementação de novas estratégias de cromatografia de afinidade que permitam melhorar e ultrapassar algumas limitações dos processos já desenvolvidos para a obtenção da isoforma sc do pDNA. Inicialmente foram realizados estudos com oligonucleótidos sintéticos para compreender as interacções envolvidas entre os ácidos nucleicos e as matrizes de afinidade, assim como as condições de eluição que favorecem o bioreconhecimento da conformação sc do pDNA pelas matrizes de histidina- e arginina-agarose já usadas na purificação destes vectores. Os resultados obtidos nesses estudos fundamentais mostraram o envolvimento de várias interacções entre os ácidos nucleicos e as matrizes de aminoácidos estudadas, tais como interacções hidrofóbicas, interacções-π, pontes de hidrogénio, pontes mediadas por água, interacções electrostáticas e forças de van der Waals. Embora as interacções hidrofóbicas prevaleçam quando se usa a matriz de histidina e as interacções iónicas com a matriz de arginina, também se observou a presença de outras interacções que se tornaram dominantes em função das condições de eluição usadas, e preponderantes para o reconhecimento específico da isoforma sc. Estes resultados forneceram informações proveitosas para a implementação de novas estratégias cromatográficas de afinidade como por exemplo com a matriz de lisina, que é um aminoácido de constituição semelhante à arginina. A cromatografia de afinidade com lisina resultou na purificação selectiva e eficiente do pDNA, apresentando uma homogeneidade superior a 97% da isoforma sc, e eliminando as impurezas do hospedeiro de E. coli, respeitando os requerimentos das agências reguladoras. O rendimento da recuperação global do pDNA no final desta etapa cromatográfica foi de 55%. No entanto, a eficiência de transfecção de células eucarióticas (COS-7) com a amostra de pDNA sc final foi consideravelmente superior à eficiência obtida com uma amostra de plasmídeo na conformação circular aberta ou relativamente à amostra de pDNA nativo purificada através de um kit comercial. Adicionalmente, foi realizado um estudo comparativo do comportamento de ligação e eluição dos vários ácidos nucleicos injectados individualmente nas três matrizes de aminoácidos anteriormente referidas, sob influência de diferentes condições de temperatura, composição e força iónica do tampão de eluição. As matrizes de histidina e lisina mostraram uma retenção preferencial pelos ácidos nucleicos com maior grau de exposição das bases nucleotídicas como por exemplo o RNA, parecendo que ambas as matrizes são indicadas para utilizar na purificação deste ácido nucleico. Tendo em conta que a matriz de lisina requer condições de eluição suaves, torna-se um método de purificação mais económico do que a histidina-agarose, principalmente para aplicar ao nível industrial. Por outro lado a argininaagarose apresentou uma retenção preferencial pela isoforma sc do plasmídeo em condições cromatográficas suaves tornando-se um suporte adequado à purificação deste vector. Embora as matrizes de afinidade com aminoácidos imobilizados permitam um reconhecimento específico e selectivo pela molécula de interesse, as limitações associadas aos suportes convencionais permanecem por resolver. Assim sendo, foi aplicado um suporte monolítico como uma alternativa cromatográfica para a purificação de pDNA, revelando boas propriedades de selectividade e transferência de massa, assim como elevada capacidade de ligação para o pDNA, permitindo uma rápida e eficiente separação das isoformas independentemente da taxa de fluxo aplicada. Tendo em conta que o monolito utilizado apresenta grupos funcionais de carbonildiimidazole e que as condições de eluição do pDNA são semelhantes às usadas na matriz de histidina-agarose, foi sugerido que o anel de imidazole presente neste disco monolítico é o principal responsável pelo reconhecimento específico da isoforma sc. A integração da cromatografia com monolitos no processo geral de obtenção do plasmídeo puro também resultou num aumento do rendimento global da etapa de recuperação de pDNA para 89%. A amostra final de pDNA sc foi obtida com um elevado grau de pureza, respeitando os critérios das agências reguladoras, que se reflectiu no aumento da eficiência de transfecção de células eucarióticas (59% com a linha celular COS-7). Este suporte monolítico além de evitar a degradação do pDNA devido ao reduzido tempo de contacto, também pode ser aplicado na purificação de plasmídeos com maiores dimensões sem grandes alterações da estratégia de purificação estabelecida. Em conclusão, este projecto de investigação revelou que a cromatografia de afinidade baseada em aminoácidos é uma metodologia poderosa e versátil para a purificação de ácidos nucleicos, especialmente da topologia sc do pDNA, com um elevado grau de pureza, adequado para aplicações terapêuticas baseadas em DNA. Além da selectividade e especificidade obtida com os ligandos de aminoácidos, a aplicação da tecnologia monolítica inovadora na purificação do pDNA forneceu grandes avanços relativamente à velocidade, resolução e capacidade da performance cromatográfica, revelando-se uma associação promissora para a tecnologia de purificação de plasmídeos. Assim, este trabalho reune informações úteis e valiosas relativamente à cromatografia de afinidade baseada em aminoácidos e dos suportes cromatográficos que podem ser aplicáveis futuramente, quer em processos preparativos quer analíticos da bioseparação do pDNA.
Descrição
Palavras-chave
Eficiência de transfecção DNA plasmídico