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Publication
Development of pH-responsive nanoparticles for the protection and delivery of RNAs to cancer cells
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Authors
Abstract(s)
Nanoparticles are receiving increased attention due to their significance in delivering
biopharmaceuticals for gene-based therapies. At the same time, RNA is being studied to
develop new and advanced treatments. However, the successful therapeutic application of
these biomolecules is highly dependent on their effectiveness in reaching target cells. The
development of pH-responsive nanoparticles may improve delivery efficiency in certain
diseases that present a microenvironment with deregulated pH, such as lung cancer. In this
work, it is explored the pH responsiveness and efficiency of a copolymer composed of poly(2-
(diisopropylamino)ethyl methacrylate)) (PDPA) and poly(oligo(ethylene oxide)methyl ether
methacrylate) (POEOMA) for the encapsulation and release of small RNAs (sRNA). The
encapsulation process relies on the electrostatic interaction between the negatively charged
sRNA and the protonated tertiary amine groups of the PDPA segment. Three copolymers
with different architectures (linear or 4-arm star-shaped) and compositions (4-arm star
PDPA-b-POEOMA or 4-arm star POEOMA-b-PDPA) were synthesized by atom transfer
radical polymerization. The sRNA and miR-29b-duplex encapsulation efficiencies were
studied by UV spectroscopy and agarose electrophoresis. The best formulations were further
characterized regarding the size and surface charge of the polyplexes, by dynamic Light
Scattering (DLS) and electrophoretic Light Scattering (ELS), respectively. Depending on the
copolymer, concentration, and pH of the formulation, the systems achieved complexation
efficiencies ranging from 35% to 84%. The polyplexes presenting higher encapsulation
efficiencies had sizes ranging from 92 to 104 nm. It was also possible to understand the
changes in the nanoparticle’s structure at different pH values with TEM, which are in
accordance with their release potential and profile, studied by UV spectroscopy and
confirmed by agarose electrophoresis. Additionally, the nanoparticles of the different
conformations were submitted to several biologically relevant conditions to evaluate their
protection capacity, where the 4-arm star, POEOMA core, and copolymer proved to have
superior properties than their linear and conformational inverse counterparts. Moreover,
cell viability, via MTS assays was employed where all three architectures proved
biocompatible. This research demonstrates the potential of pH-sensitive polymers as promising
RNA delivery systems, and how the different conformations inside the same copolymer
block combination can influence its overall performance as an effective delivery vehicle.
O cancro do pulmão é uma das principais causas de morte a nível global, sendo o segundo tipo de tumor mais diagnosticado. A elevada taxa de mortalidade pode ser atribuída à baixa eficiência apresentada pelos tratamentos convencionais, devido à falta de especificidade, direcionamento, para além da elevada heterogeneidade encontrada neste tipo de tumor. Assim, devido à necessidade de ultrapassar estas lacunas existentes, um maior interesse em explorar novas alternativas terapêuticas foi surgindo nas últimas décadas. A terapia génica tem vindo a gerar grande interesse como possível terapia de primeira linha, sendo atualmente uma das áreas de investigação mais extensas, para o cancro do pulmão. Esta via terapêutica, tem como objetivo desenvolver um tratamento seguro e mais eficiente, através da identificação correta de genes e mutações específicas a cada caso individual, permitindo um tratamento personalizado para a eliminação de células cancerígenas. A utilização de microRNAs (miRNAs) tem surgido como uma alternativa interessante para serem usados como biofármacos para o tratamento de diversas doenças, incluindo o cancro do pulmão. Estes são pequenos RNAs não codificantes, responsáveis pela modulação da expressão génica, a nível pós-transcricional, através de mecanismos de degradação e silenciamento de RNA mensageiro (mRNA) específico. Estes apresentam elevada importância em processos fisiológicos, mais concretamente na reparação de DNA e controlo de proliferação celular em células pré-cancerosas. Dentro das vastas famílias existentes de miRNAs, a família miRNA-29 (29a, 29b, 29c) é muito importante no cancro do pulmão. Isto é principalmente devido à sua complementaridade com as regiões 3’UTR do mRNA que codifica as DNA metiltransferases (DNMTs), proteínas frequentemente desreguladas e responsáveis por fenótipos de hipermetilação de DNA no cancro do pulmão. Apesar da sua utilidade farmacológica, a entrega destes pequenos fragmentos de informação às células, impõe os seus próprios desafios, pois devido à sua fragilidade estes são facilmente degradados na corrente sanguínea. Por outro lado, a falta de direcionamento e especificidade dos veículos de entrega existentes, afetam a eficiência global do processo de entrega e assim a eficácia do tratamento. Aliada aos avanços efetuados na terapia génica, a necessidade de desenvolver novos veículos de entrega seguros e eficazes tem também gerado grande interesse na área da nanotecnologia. Diversas combinações co-poliméricas têm vindo a emergir como potenciais candidatas a um novo “golden standard” de nanomateriais, ao potenciarem o aproveitamento de diversas qualidades inerentes de cada material. Por outro lado, certos veículos de entrega co-poliméricos foram desenhados para protegerem e libertarem a sua carga apenas em condições específicas, respondendo a estímulos externos como a temperatura, potencial redox, ou pH. Este último parâmetro apresenta-se particularmente interessante, pois doenças como o cancro apresentam valores de pH diferentes comparativamente ao microambiente providenciado em células normais, possibilitando um “pseudo” direcionamento, onde as nanopartículas utilizadas apenas libertam a sua carga terapêutica nas condições de pH desejados. Várias combinações co-poliméricas já foram utilizadas tendo obtido resultados promissores. Dentro destes, a utilização de copolímeros de base poly(2-(diisopropylamino)ethyl methacrylate)) (PDPA) e poly(oligo(ethylene oxide)methyl ether methacrylate) (POEOMA) apresentam uma alternativa interessante para a entrega de ácidos nucleicos com fim terapêutico. Devido aos grupos catiónicos presentes no PDPA em determinados valores de pH, ocorre uma interação ou repulsão com os grupos carregados negativamente dos ácidos nucleicos. Isso ocorre porque, tendo em consideração o seu pKa e dependendo do pH do ambiente, a protonação dos grupos funcionais carregados positivamente do PDPA varia, modulando a complexação ou libertação dos ácidos nucleicos dos poliplexos formados. Este polímero, quando utilizado conjuntamente com polímeros hidrofílicos e biocompatíveis, como o POEOMA, permite uma entrega e proteção eficiente de diversos ácidos nucleicos. No entanto, os trabalhos com esta combinação copolimérica, ou outras, apenas contabilizam as diferenças no tamanho quando são usados os blocos poliméricos na forma linear, não tendo em consideração as diferentes conformações arquitetónicas (linear vs estrelado, entre outras) que os diferentes veículos de entrega poliméricos podem apresentar. Desta forma, este trabalho baseou-se na tentativa de verificar como as diferentes conformações (linear ou 4-arm star) dentro da mesma combinação copolimérica e com tamanho de cadeia similar, pode afetar as suas características de encapsulação, morfologia, proteção e entrega de pequenos RNAs (sRNAs). Para este fim numa primeira etapa sintetizaram-se três copolímeros de base de POEOMA-b-PDPA com diferentes conformações, nomeadamente linear POEOMA22-b-PDPA87, 4-arm star de PDPA e core de POEOMA (POEOMA21-b-PDPA88) e o seu inverso conformacional 4-arm star de POEOMA e core de PDPA (PDPA89-b-POEOMA20). Foram posteriormente estudadas as eficiências de encapsulação, para diferentes concentrações dos diferentes copolímeros, onde foram obtidas eficiências de encapsulação entre 35 e 84% dependendo das condições de formulação para amostras de sRNA. Após selecionadas as condições e concentrações mais favoráveis para formulação de nanopartículas de POEOMA-b-PDPA, foram posteriormente caracterizadas em termos de tamanho e carga de superfície por difusão dinâmica de luz (DLS) e dispersão de luz eletroforética (ELS). Apesar de as diferentes conformações em estudo, apresentarem tamanhos similares, entre 92 e 104 nm, foram observadas diferentes características entre estas, sendo a mais notória a inversão entre carga superficial dos sistemas, sendo que quando é usado o POEOMA no core, o sistema exibe uma forte carga positiva e o seu inverso conformacional, com o PDPA no core, apresenta carga de superfície negativa. Além destas características, a sua responsividade ao pH e perfil de libertação em condições biologicamente relevantes também foram avaliadas. Foi verificado que o polímero com PDPA no core, ao apresentar teoricamente, uma conformação onde o RNA se encontra mais exposto, apresenta maior facilidade de libertação nas diferentes condições de pH a que o poliplexo foi exposto. Contrariamente, o seu inverso conformacional, POEOMA no core, apresenta maior estabilidade, e assim maior resistência às variações de pH do meio. Após esta análise às diferentes mudanças de pH inerentes às condições fisiológicas a que os copolímeros foram sujeitos, foi também completado o estudo com a avaliação por microscopia eletrónica de transmissão (TEM). Este ensaio teve como objetivo obter uma maior perceção das alterações morfológicas dos diferentes poliplexos dependendo das diferentes condições de pH. Pelo que se observou, o grau de alteração morfológica inerente a cada polímero encontra-se em concordância com os resultados anteriores. Após caracterização morfológica, foram efetuados ensaios de proteção em diferentes ressuspensões, numa tentativa de mimetizar as condições biológicas, nomeadamente quanto à presença de proteínas e RNAses encontradas no plasma humano. Estes resultados mostraram que a utilização de estruturas estreladas POEOMA core, podem apresentar níveis de proteção maiores, comparativamente às estruturas lineares. No entanto também foi verificado que a sua eficiência dependerá da conformação utilizada, pois o seu inverso conformacional apresenta piores resultados de proteção que o polímero linear e também que o seu inverso conformacional. Por fim, as formulações que até então apresentaram melhores resultados foram testadas, utilizando um miRNA de elevado valor biológico, o miRNA-29b. Foi verificado que as eficiências de encapsulação obtidas foram muito idênticas às obtidas com o RNA modelo (sRNA). De seguida, foi avaliada citotoxicidade das diferentes conformações, que revelou a biocompatibilidade dos sistemas. Pelo exposto e com os resultados obtidos, podemos afirmar que a utilização de diferentes arquiteturas conformacionais pode conferir alternativas interessantes dentro da mesma combinação copolimérica, aumentando a versatilidade oferecida por veículos de entrega de ácidos nucleicos com potencial ação terapêutica.
O cancro do pulmão é uma das principais causas de morte a nível global, sendo o segundo tipo de tumor mais diagnosticado. A elevada taxa de mortalidade pode ser atribuída à baixa eficiência apresentada pelos tratamentos convencionais, devido à falta de especificidade, direcionamento, para além da elevada heterogeneidade encontrada neste tipo de tumor. Assim, devido à necessidade de ultrapassar estas lacunas existentes, um maior interesse em explorar novas alternativas terapêuticas foi surgindo nas últimas décadas. A terapia génica tem vindo a gerar grande interesse como possível terapia de primeira linha, sendo atualmente uma das áreas de investigação mais extensas, para o cancro do pulmão. Esta via terapêutica, tem como objetivo desenvolver um tratamento seguro e mais eficiente, através da identificação correta de genes e mutações específicas a cada caso individual, permitindo um tratamento personalizado para a eliminação de células cancerígenas. A utilização de microRNAs (miRNAs) tem surgido como uma alternativa interessante para serem usados como biofármacos para o tratamento de diversas doenças, incluindo o cancro do pulmão. Estes são pequenos RNAs não codificantes, responsáveis pela modulação da expressão génica, a nível pós-transcricional, através de mecanismos de degradação e silenciamento de RNA mensageiro (mRNA) específico. Estes apresentam elevada importância em processos fisiológicos, mais concretamente na reparação de DNA e controlo de proliferação celular em células pré-cancerosas. Dentro das vastas famílias existentes de miRNAs, a família miRNA-29 (29a, 29b, 29c) é muito importante no cancro do pulmão. Isto é principalmente devido à sua complementaridade com as regiões 3’UTR do mRNA que codifica as DNA metiltransferases (DNMTs), proteínas frequentemente desreguladas e responsáveis por fenótipos de hipermetilação de DNA no cancro do pulmão. Apesar da sua utilidade farmacológica, a entrega destes pequenos fragmentos de informação às células, impõe os seus próprios desafios, pois devido à sua fragilidade estes são facilmente degradados na corrente sanguínea. Por outro lado, a falta de direcionamento e especificidade dos veículos de entrega existentes, afetam a eficiência global do processo de entrega e assim a eficácia do tratamento. Aliada aos avanços efetuados na terapia génica, a necessidade de desenvolver novos veículos de entrega seguros e eficazes tem também gerado grande interesse na área da nanotecnologia. Diversas combinações co-poliméricas têm vindo a emergir como potenciais candidatas a um novo “golden standard” de nanomateriais, ao potenciarem o aproveitamento de diversas qualidades inerentes de cada material. Por outro lado, certos veículos de entrega co-poliméricos foram desenhados para protegerem e libertarem a sua carga apenas em condições específicas, respondendo a estímulos externos como a temperatura, potencial redox, ou pH. Este último parâmetro apresenta-se particularmente interessante, pois doenças como o cancro apresentam valores de pH diferentes comparativamente ao microambiente providenciado em células normais, possibilitando um “pseudo” direcionamento, onde as nanopartículas utilizadas apenas libertam a sua carga terapêutica nas condições de pH desejados. Várias combinações co-poliméricas já foram utilizadas tendo obtido resultados promissores. Dentro destes, a utilização de copolímeros de base poly(2-(diisopropylamino)ethyl methacrylate)) (PDPA) e poly(oligo(ethylene oxide)methyl ether methacrylate) (POEOMA) apresentam uma alternativa interessante para a entrega de ácidos nucleicos com fim terapêutico. Devido aos grupos catiónicos presentes no PDPA em determinados valores de pH, ocorre uma interação ou repulsão com os grupos carregados negativamente dos ácidos nucleicos. Isso ocorre porque, tendo em consideração o seu pKa e dependendo do pH do ambiente, a protonação dos grupos funcionais carregados positivamente do PDPA varia, modulando a complexação ou libertação dos ácidos nucleicos dos poliplexos formados. Este polímero, quando utilizado conjuntamente com polímeros hidrofílicos e biocompatíveis, como o POEOMA, permite uma entrega e proteção eficiente de diversos ácidos nucleicos. No entanto, os trabalhos com esta combinação copolimérica, ou outras, apenas contabilizam as diferenças no tamanho quando são usados os blocos poliméricos na forma linear, não tendo em consideração as diferentes conformações arquitetónicas (linear vs estrelado, entre outras) que os diferentes veículos de entrega poliméricos podem apresentar. Desta forma, este trabalho baseou-se na tentativa de verificar como as diferentes conformações (linear ou 4-arm star) dentro da mesma combinação copolimérica e com tamanho de cadeia similar, pode afetar as suas características de encapsulação, morfologia, proteção e entrega de pequenos RNAs (sRNAs). Para este fim numa primeira etapa sintetizaram-se três copolímeros de base de POEOMA-b-PDPA com diferentes conformações, nomeadamente linear POEOMA22-b-PDPA87, 4-arm star de PDPA e core de POEOMA (POEOMA21-b-PDPA88) e o seu inverso conformacional 4-arm star de POEOMA e core de PDPA (PDPA89-b-POEOMA20). Foram posteriormente estudadas as eficiências de encapsulação, para diferentes concentrações dos diferentes copolímeros, onde foram obtidas eficiências de encapsulação entre 35 e 84% dependendo das condições de formulação para amostras de sRNA. Após selecionadas as condições e concentrações mais favoráveis para formulação de nanopartículas de POEOMA-b-PDPA, foram posteriormente caracterizadas em termos de tamanho e carga de superfície por difusão dinâmica de luz (DLS) e dispersão de luz eletroforética (ELS). Apesar de as diferentes conformações em estudo, apresentarem tamanhos similares, entre 92 e 104 nm, foram observadas diferentes características entre estas, sendo a mais notória a inversão entre carga superficial dos sistemas, sendo que quando é usado o POEOMA no core, o sistema exibe uma forte carga positiva e o seu inverso conformacional, com o PDPA no core, apresenta carga de superfície negativa. Além destas características, a sua responsividade ao pH e perfil de libertação em condições biologicamente relevantes também foram avaliadas. Foi verificado que o polímero com PDPA no core, ao apresentar teoricamente, uma conformação onde o RNA se encontra mais exposto, apresenta maior facilidade de libertação nas diferentes condições de pH a que o poliplexo foi exposto. Contrariamente, o seu inverso conformacional, POEOMA no core, apresenta maior estabilidade, e assim maior resistência às variações de pH do meio. Após esta análise às diferentes mudanças de pH inerentes às condições fisiológicas a que os copolímeros foram sujeitos, foi também completado o estudo com a avaliação por microscopia eletrónica de transmissão (TEM). Este ensaio teve como objetivo obter uma maior perceção das alterações morfológicas dos diferentes poliplexos dependendo das diferentes condições de pH. Pelo que se observou, o grau de alteração morfológica inerente a cada polímero encontra-se em concordância com os resultados anteriores. Após caracterização morfológica, foram efetuados ensaios de proteção em diferentes ressuspensões, numa tentativa de mimetizar as condições biológicas, nomeadamente quanto à presença de proteínas e RNAses encontradas no plasma humano. Estes resultados mostraram que a utilização de estruturas estreladas POEOMA core, podem apresentar níveis de proteção maiores, comparativamente às estruturas lineares. No entanto também foi verificado que a sua eficiência dependerá da conformação utilizada, pois o seu inverso conformacional apresenta piores resultados de proteção que o polímero linear e também que o seu inverso conformacional. Por fim, as formulações que até então apresentaram melhores resultados foram testadas, utilizando um miRNA de elevado valor biológico, o miRNA-29b. Foi verificado que as eficiências de encapsulação obtidas foram muito idênticas às obtidas com o RNA modelo (sRNA). De seguida, foi avaliada citotoxicidade das diferentes conformações, que revelou a biocompatibilidade dos sistemas. Pelo exposto e com os resultados obtidos, podemos afirmar que a utilização de diferentes arquiteturas conformacionais pode conferir alternativas interessantes dentro da mesma combinação copolimérica, aumentando a versatilidade oferecida por veículos de entrega de ácidos nucleicos com potencial ação terapêutica.
Description
Keywords
Cancro do Pulmão Mirna-29 Nanopartículas Poeoma-B-Pdpa Polímeros Responsivos ao Ph