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Authors
Abstract(s)
The demand of high-purity supercoiled (sc) plasmid DNA (pDNA) to be applied as a vector for
new therapeutic strategies, such as gene therapy or DNA vaccination has increased in the last
years. Thus, it is necessary the implementation of an analytical technique suitable to control
the quality of the sc pDNA as a pharmaceutical product, during the manufacturing process.
The present study describes a new methodology to quantify and monitor the purity of sc
pDNA, using a monolithic column based on anion-exchange chromatography. This analytical
method with UV detection allows the separation of the plasmid isoforms by using a NaCl
stepwise gradient. The selectivity, linearity, accuracy, reproducibility and repeatability of
the method have been evaluated, and the lower quantification and detection limits were also
established. The validation was performed according to the guidelines, being demonstrated
that the method is precise and accurate for a sc plasmid concentration up to 200 µg/mL. The
main advance achieved by using this monolithic method is the possibility to quantify the sc
plasmid in a sample containing other plasmid topologies, in a 4 minutes experiment. This
column also permits the assessment of the sc pDNA present in more complex samples,
allowing the control of pDNA throughout the bioprocess. Thus, these findings strengthen the
possibility of using this monolithic column associated with a powerful analytical method to
control the downstream process of sc pDNA for therapeutic applications.
Nos últimos anos tem aumentado a exigência para obtenção de DNA plasmídico superenrolado de elevada pureza de forma a ser aplicado como vector em novas estratégias terapêuticas, como a terapia génica ou as vacinas de DNA. Assim, é necessário implementar uma técnica analítica adequada para controlar a qualidade do plasmídeo superenrolado, como um produto farmacêutico, durante o processo de produção. O presente estudo descreve o desenvolvimento de uma nova metodologia para quantificar e controlar a pureza do plasmídeo superenrolado, usando uma coluna monolítica que se baseia em cromatografia de troca aniónica. Este método analítico com detecção UV permite a separação das isoformas do plasmídeo, usando um gradiente por passos de NaCl. Avaliou-se a selectividade, linearidade, exatidão, reprodutibilidade e repetibilidade do método, e também se estabeleceram os limites inferiores de quantificação e de detecção. A validação foi realizada de acordo com as directivas, sendo demonstrado que o método é preciso e exato até uma concentração de plasmídeo superenrolado de 200 μg/mL. O principal avanço alcançado ao usar este método é a possibilidade de quantificar plasmídeo superenrolado numa amostra contendo outras topologias do plasmídeo, num ensaio de 4 minutos. Esta coluna também possibilita a avaliação de plasmídeo superenrolado presente em amostras mais complexas, permitindo o controlo ao longo do bioprocesso. Assim, estes resultados confirmam a possibilidade de utilizar esta coluna monolítica associada a um método analítico poderoso no controlo do processo “downstream” do plasmídeo superenrolado para aplicações terapêuticas.
Nos últimos anos tem aumentado a exigência para obtenção de DNA plasmídico superenrolado de elevada pureza de forma a ser aplicado como vector em novas estratégias terapêuticas, como a terapia génica ou as vacinas de DNA. Assim, é necessário implementar uma técnica analítica adequada para controlar a qualidade do plasmídeo superenrolado, como um produto farmacêutico, durante o processo de produção. O presente estudo descreve o desenvolvimento de uma nova metodologia para quantificar e controlar a pureza do plasmídeo superenrolado, usando uma coluna monolítica que se baseia em cromatografia de troca aniónica. Este método analítico com detecção UV permite a separação das isoformas do plasmídeo, usando um gradiente por passos de NaCl. Avaliou-se a selectividade, linearidade, exatidão, reprodutibilidade e repetibilidade do método, e também se estabeleceram os limites inferiores de quantificação e de detecção. A validação foi realizada de acordo com as directivas, sendo demonstrado que o método é preciso e exato até uma concentração de plasmídeo superenrolado de 200 μg/mL. O principal avanço alcançado ao usar este método é a possibilidade de quantificar plasmídeo superenrolado numa amostra contendo outras topologias do plasmídeo, num ensaio de 4 minutos. Esta coluna também possibilita a avaliação de plasmídeo superenrolado presente em amostras mais complexas, permitindo o controlo ao longo do bioprocesso. Assim, estes resultados confirmam a possibilidade de utilizar esta coluna monolítica associada a um método analítico poderoso no controlo do processo “downstream” do plasmídeo superenrolado para aplicações terapêuticas.
Description
Keywords
DNA plasmídico DNA plasmídico superenrolado - Método analítico