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Publicação
Strategies of plasmid DNA production and their influence on therapeutic applications
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Resumo(s)
Current developments in gene therapy and DNA vaccination, plasmid DNA vectors are becoming increasingly appealing as therapeutics towards a large number of diseases such as cancer, infectious and cardiovascular diseases. This popularity is creating the demand for high quantities of highly purified plasmid DNA which in turn requires the design of high pDNA yield bioprocesses. However, opposed to recombinant protein production, research on pDNA production is still needed, in order to have a clear comprehension of all the challenges and bottlenecks faced during the production of plasmid DNA (pDNA). The design of a plasmid DNA production process usually begins with the choice of a suitable culture medium to cultivate the expression system containing the therapeutic plasmid. After defining all medium components, the influence of culture conditions, such as pH, temperature and dissolved oxygen, on biomass and plasmid yields is generally studied. Since the appropriate conditions for maximizing biomass production and plasmid replication are not usually the same, a compromise solution is usually considered in these cases. When designing a large scale plasmid DNA production process, the employment of a correct fermentation strategy is also necessary in order to improve yields while reducing production costs. So far, reports on plasmid DNA production in E. coli are focused essentially on the influence of different medium composition, fermentation conditions and feeding strategies on overall biomass and pDNA mass and volumetric titres. Nevertheless, due to the complex nature of microbial growth and the application of several modes of operation such as batch, fed-batch and continuous cultivations, the constant monitoring and control of pDNA bioprocesses represents an engineering challenge that should not be disregarded. As a highest yield process may not correspond necessarily to the best fermentation design, the improvement in off-line, at-line and online monitoring techniques should be seen as a crucial task in the design of the fermentation. Two of the most relevant factors for fermentation performance are the existence of host cell metabolic stress and plasmid instability; hence, the characterization of cell physiology and plasmid segregational stability has to be considered and monitored during the process. With this thesis, we attempted to improve plasmid DNA yields while gaining new insights on plasmid DNA fermentation processes through the use of novel monitoring techniques such as flow cytometry and real-time quantitative PCR. We started this work studying the influence of growth temperature and tryptone concentration on plasmid DNA production in a previously developed semi-defined medium. The analysis of pDNA yields and E. coli morphology revealed that higher pDNA specific yields were obtained at higher temperatures (37 and 40 ºC). Also, at these temperatures, E. coli filamentation was observed, possibly indicating a higher metabolic stress due to higher plasmid replication and higher culture temperatures. When analyzing the influence of tryptone concentration on plasmid yield, the best results were achieved with the lowest tryptone concentration used. The use of limiting tryptone concentrations at a temperature of 37 ºC was shown to be a powerful tool to promote plasmid amplification, keeping the desirable plasmid structure (supercoiled isoform); thus favouring the attainment of product quality. Our results suggest that by using tryptone alone as an amino acid source, pDNA amplification was improved, proving that this strategy is able to increase pDNA yield even at small scale. Since this first study revealed some evidence of E. coli metabolic stress during cultivation, the next task consisted in the development of new flow cytometric methodologies that allowed single cell physiology monitoring during cultivation for a better understanding of cultivation conditions influence in the host metabolic activity. Because one of the parameters that enable a better characterization of cell metabolic cell as well as population heterogeneity is cell cycle progression, in the second part of the work, we developed a flow cytometric method to evaluate cell cycle progression in E. coli cultivation using a newly developed far-red dye, DRAQ5. In this study we demonstrated that the use of DRAQ5 as a DNA-specific labelling stain provided an easy assessment of intracellular DNA content and cell-cycle phases in the Gram-negative bacteria E. coli. Besides the previously reported method for cell cycle analysis, another method for assessing cell viability was implemented using flow cytometry. In this method, a propidium iodide/bis- (1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol (BOX) dual staining was used to distinguish between three different populations: healthy cells (no staining), cells with depolarized membranes (stained with BOX) and cells with permeabilized membranes (stained with propidium iodide and BOX). In order to evaluate plasmid copy number (PCN) throughout the fermentation, a real-time quantitative PCR method was developed for absolute plasmid copy number quantification in whole E. coli cells. After developing and implementing these methods, we evaluated the impact of several plasmid DNA induction strategies, such as amino acid limitation, AMP addition and temperature up-shift, on cell physiology and plasmid segregational stability. This study showed that all induction strategies caused cell filamentation, due to an increase in forward scatter values, and decreased viability at the end of fermentation, as was seen by an increase in the percentage of depolarized and permeabilized cells. The results also suggest that an amino acid limitation with AMP addition induction strategy resulted in the highest specific yields and, concomitantly, highest PCN values. In conclusion, amino acid limitation-based amplification strategies seemed to be suitable approaches to be implemented at a large scale level since they do not require any additional energy and also had proved to be efficient in plasmid amplification, without causing any detrimental effects in plasmid stability and cellular viability. The last step of this work aimed at improving plasmid DNA yield through the study of different batch and fed-batch fermentations in bioreactors. Also, the influence of different glycerol and tryptone concentrations and different non-feedback feeding profiles, namely exponential and constant feed rates, on cell physiology and plasmid stability was evaluated by means of flow cytometry and real-time qPCR, respectively; investigating the potential of these two techniques as valuable tools for bioprocess monitoring and design. The results showed that all fermentation strategies caused a slight decrease of cell viability at the end of fermentation, being this decrease more pronounced in fed-batch fermentations than in batch fermentations. The time-course assessment of plasmid copy number revealed that PCN values suffered an increase at the end of batch fermentations, which is in agreement with our previous results obtained in batch fermentations performed in shake flasks. However, in fedbatch fermentations, there were pronounced fluctuations in PCN values throughout the fermentations, indicating some plasmid segregational instability. As supposed, fed-batch fermentations with exponential or constant feeding profiles yielded higher biomass and plasmid DNA than batch fermentations with the highest biomass and plasmid yields being obtained with a fed-batch strategy with an exponential feed rate of 0.2 h-1. Notwithstanding the high biomass (95.64 OD600) and plasmid yields (344.30 mg pDNA/L) obtained, this fermentation also exhibited higher plasmid instability and lower percentage of viable cells. This work showed that the fermentation strategy used, not only influences product yield, but also cell physiology and pDNA segregational stability. Furthermore, the new findings described herein draw attention towards the relevance of monitoring bioprocess performance and not just overall biomass and product yields. In conclusion, in this thesis we evaluated and improved pVAX1-LacZ plasmid production in Escherichia coli DH5 alpha taking into account not only the overall biomass and plasmid yields, but also considering that cell physiology and plasmid segregational stability, that are two pivotal features to the design and development of these production bioprocesses. In order to study these two factors, several techniques were implemented and were later used to evaluate the influence of several fermentation parameters such as induction strategies and fermentation strategies on overall process performance.
A terapia génica e as vacinas de DNA são abordagens promissoras para a prevenção e possível cura de doenças como cancro, infeções virais, como HIV e hepatite, doenças cardiovasculares, entre outras. Os constantes progressos no aumento da eficácia na transfecção de moléculas de DNA plasmídico (pDNA), faz com que este vetor não viral seja visto cada vez mais como um vetor viável para uso em terapia génica ou vacinação com DNA. Assim sendo, torna-se relevante a obtenção de elevadas quantidades de DNA plasmídico com elevado grau de pureza para ser posteriormente usado em aplicações terapêuticas. Para atingir este objetivo, é necessária a combinação entre a otimização das condições de crescimento para a produção de DNA plasmídico e a eficiência do processo de purificação. Apesar de, até à data, grande parte da pesquisa se ter focado no desenvolvimento do processo de purificação; o passo limitante do processo global continua a ser a produção de pDNA, que quando otimizada permite melhorar os processos de purificação subsequentes pela redução da fração de contaminantes (DNA genómico, RNA, proteínas e endotoxinas). A Food and Drug Administration (FDA) reconhece que as conformações circular aberta e linear são, terapeuticamente, menos eficazes que a conformação superenrolada. Assim, torna-se importante que, nos processos de purificação, se efetue a separação entre as outras isoformas e o plasmídeo superenrolado e, uma vez que esta operação pode ser bastante difícil durante a purificação, o processo de fermentação deve ser otimizado de modo a produzir uma elevada percentagem de plasmídeo na conformação superenrolada. O design e otimização de um processo de produção engloba múltiplas etapas de seleção tendo em vista a escolha do bioprocesso com o maior rendimento em termos de DNA plasmídico. A primeira etapa neste design é a escolha da estirpe hospedeira e do vetor a utilizar para a produção do plasmídeo contendo a sequência terapêutica de interesse. Apesar de já terem sido propostos outros microrganismos para produção recombinante de biomoléculas, a bactéria Escherichia coli continua a ser a mais utilizada para este fim. Atualmente, devido à constante evolução da biologia molecular e engenharia genética, encontra-se disponível uma grande variedade de estirpes recombinantes de E. coli e de vetores otimizados para a produção de DNA plasmídico. Para a produção de pDNA, as estirpes de E. coli usadas possuem, geralmente, mutações em genes de recombinação e de produção de endonucleases, proporcionando uma maior estabilidade do vetor. Em relação aos vetores, têm sido propostas novas estratégias para uma produção mais eficiente e para um aumento da segurança destes vetores, reduzindo os elementos procariotas e melhorando o controlo da integração da sequência terapêutica no genoma do hospedeiro. De entre estas novas estratégias destacamse os plasmídeos minicirculares, os plasmídeos de tamanho reduzido (MIDGE) e ainda a introdução do transposão “Sleeping Beauty”. Relativamente à produção de pDNA em Escherichia coli, existem dois fatores que podem influenciar consideravelmente o processo de produção: a estabilidade plasmídica e o stress metabólico imposto à estirpe hospedeira pela manutenção e replicação do plasmídeo. Estes dois fatores podem levar a uma diminuição da produtividade do processo devido ao aumento da instabilidade do plasmídeo a vários níveis (segregacional, estrutural e relativamente às isoformas) e a uma redução do crescimento da estirpe hospedeira devido a uma limitação da capacidade biossintética e produção de energia das células. Após uma seleção preliminar do sistema de expressão, tendo em conta todos os fatores já descritos, o passo seguinte consiste na formulação de um meio de cultura contendo os componentes apropriados, não só para o crescimento, como também para a produção de DNA plasmídico. Estes componentes incluem uma fonte de carbono, uma ou várias fonte(s) de azoto, um sistema tamponante, geralmente contendo fosfatos e vários elementos vestigiais (cálcio, ferro, molibdénio, entre outros). No caso particular da produção de pDNA, o meio de cultura também deve conter sulfato de magnésio, numa concentração de aproximadamente 80 mM, uma vez que este parece causar um aumento da produção da isoforma superenrolada. Após definição do meio de cultura, o próximo passo é a definição das condições de cultura, como pH, teor de oxigénio dissolvido e temperatura. A definição das condições de cultura não deve ser efetuada apenas tendo em conta a obtenção de elevadas quantidades de biomassa, mas também a produção de DNA plasmídico. Por exemplo, está descrito que temperaturas mais elevadas (37-42 ºC) e teores de oxigénio dissolvido mais baixos causam um aumento da produção de pDNA; contudo, estas mesmas condições também são responsáveis por uma diminuição do crescimento de E. coli, levando à produção de uma menor quantidade de biomassa. A otimização das condições de cultura, por si só, leva, geralmente, a um aumento da produção de pDNA. Todavia, têm sido propostas várias estratégias de indução de DNA plasmídico que poderão conduzir a maiores produtividades, uma vez que estas causam a amplificação seletiva de pDNA, aumentando o número de cópias de plasmídeo por célula e, por conseguinte, levam a um aumento da produção de pDNA com uma concomitante redução da quantidade de contaminantes para os processos subsequentes de purificação. Estas estratégias de indução incluem a adição de cloranfenicol e adenosina monofosfato (AMP), limitação de aminoácidos e aumento de temperatura. Após seleção de todos estes parâmetros, a transição para bioreactor torna necessária a escolha da estratégia de fermentação apropriada. De entre as estratégias de fermentação descritas para a produção de pDNA, nomeadamente “batch”, “fed-batch” e contínuo; a mais utilizada e descrita como aquela que possibilita uma maior produtividade de pDNA é a fermentação em modo “fedbatch”. A fermentação em “fed-batch” é a mais utilizada para a produção de pDNA uma vez que possibilita a obtenção de elevadas densidades óticas e baixa acumulação de produtos tóxicos resultantes do metabolismo como o acetato, por exemplo. Uma vez que há diversos fatores que podem influenciar um bioprocesso para produção de DNA plasmídico, torna-se necessário desenvolver novas metodologias e técnicas que forneçam uma análise do processo num espaço de tempo que permita ao investigador alterar o seu processo a fim de atingir uma maior produtividade. Tendo em consideração que o stress metabólico imposto pelo plasmídeo bem como a instabilidade plasmídica são potenciais fatores limitantes para um processo de produção de pDNA, o desenvolvimento de novas técnicas de monitorização, bem como a aplicação de técnicas já existentes, deve ter em conta a análise destes dois fatores. Estes métodos de monitorização, para além de serem utilizados para uma melhor compreensão da performance dos bioprocessos, também permitem a identificação de possíveis alvos para engenharia metabólica das estirpes e vetores a fim de reduzir o stress metabólico e a instabilidade plasmídica, conduzindo à obtenção de maiores produtividades, reduzindo assim o custo global do processo. Assim sendo, o principal objetivo desta tese foi a otimização da produção de DNA plasmídico em Escherichia coli, numa primeira fase em erlenmeyer e, posteriormente, em bioreactores de bancada. Primeiramente foi estudada a influência das condições de cultura na produção de pDNA, utilizando um meio de cultura semi-definido previamente desenvolvido pelo nosso grupo. Seguidamente, foram desenvolvidas novas metodologias para a análise da fisiologia celular do hospedeiro e estabilidade segregacional do plasmídeo, uma vez que o primeiro estudo evidenciou que as condições de cultura poderiam estar a influenciar o stress metabólico da célula e a estabilidade do plasmídeo. Após o desenvolvimento destas metodologias de citometria de fluxo e PCR em tempo real, a análise da fisiologia celular e estabilidade plasmídica foi aplicada a um estudo comparativo entre algumas das diferentes estratégias de indução de pDNA atualmente descritas. O objetivo final do trabalho consistiu na otimização da produção em bioreactor, estudando a influência de diferentes estratégias de fermentação na produção de pDNA, monitorizando a estabilidade plasmídica e a fisiologia celular ao longo do processo. No design deste bioprocesso para produção de pDNA, a primeira etapa do estudo consistiu, então, no desenvolvimento de um meio semi-definido contendo glicerol como fonte de carbono e triptona como fonte de azoto. Após o desenvolvimento do meio semi-definido, o nosso primeiro objetivo baseou-se no estudo da influência das condições de cultura, como a temperatura e a concentração de triptona, sobre o rendimento global de pDNA em erlenmeyer. Para os estudos de temperatura, as células foram cultivadas em diferentes temperaturas de crescimento: 30, 32, 37, 40 e 42 ºC. Este estudo revelou que as temperaturas mais elevadas causaram filamentação das células de E. coli. A análise de outros parâmetros relacionados com o crescimento celular, como a taxa específica de crescimento e a produção de biomassa, juntamente com a análise da produção de pDNA, revelaram baixas taxas de crescimento e uma menor produção de biomassa para as temperaturas mais elevadas. Estes resultados levantaram a hipótese de que a ocorrência de filamentação celular poderia ser devida a um aumento do stress metabólico imposto pela manutenção e replicação do plasmídeo na célula hospedeira. A obtenção de maiores rendimentos específicos de pDNA e graus de pureza para as temperaturas mais elevadas, facto este que pode ser interpretado como sinónimo da existência de um maior número de cópias do plasmídeo por célula hospedeira, pode ser vista como uma das causas para este aumento do stress metabólico da célula. Uma vez que tinha sido descrito que condições de limitação de aminoácidos causavam amplificação de pDNA em E. coli, o próximo passo consistiu no estudo da influência de concentrações limitantes (0.5, 1 e 3 g/L) e não limitantes (5 e 20 g/L) de triptona na produção de pDNA. Os resultados obtidos demonstraram que o uso de concentrações reduzidas de triptona levava a um aumento da produção específica de pDNA, demonstrando que a limitação de aminoácidos leva a uma amplificação de pDNA, o que está relacionado com o facto de a estirpe utilizada ser uma estirpe relA- . Devido aos resultados obtidos neste primeiro estudo, havia evidências de que a fisiologia celular seria um fator importante a ter em conta no desenvolvimento e otimização deste processo de produção de pDNA. Assim sendo, a próxima etapa deste trabalho consistiu no desenvolvimento e implementação de metodologias que permitissem uma avaliação da fisiologia celular tendo por base a citometria de fluxo. A escolha da citometria de fluxo como técnica de monitorização deveu-se, sobretudo, ao facto de possibilitar a análise de cada célula da população individualmente e fornecer uma elevada quantidade de dados de forma rápida permitindo, assim, uma análise em linha dos bioprocessos. Uma vez que a análise do DNA bacteriano é considerada uma mais-valia para o controlo de bioprocessos e como ainda não se encontram descritos muitos protocolos para esta análise aplicada a bioprocessos; de seguida, procedeu-se ao desenvolvimento e validação de um protocolo de citometria de fluxo para a monitorização do ciclo celular durante os processos de fermentação de Escherichia coli. Este protocolo foi desenvolvido utilizando o fluorocromo DRAQ5, uma vez que, devido às suas características espetrais, não necessita de um citómetro com laser ultra-violeta (UV) e permite ser conjugado com outros fluorocromos. Apesar de os resultados obtidos demonstrarem que o DRAQ5 era capaz de marcar células de E. coli vivas, devido aos baixos valores de fluorescência obtidos e ao facto de não ser possível o estudo do ciclo celular nestas condições, investigou-se a capacidade de análise do ciclo celular em células de E. coli fixadas com etanol ou glutaraldeído. Depois de determinar as condições de incubação adequadas, concentração de fluorocromo e agente fixante (etanol), as células de Escherichia coli não contendo plasmídeo foram cultivadas em meio semidefinido, a fim de avaliar a aplicabilidade do DRAQ5 para monitorizar o ciclo celular em fermentações bacterianas. Os resultados obtidos demonstraram que esta estirpe de E. coli, nas condições referidas, tem um ciclo celular em que alterna entre um e dois cromossomas e, também, o aumento da população de células com apenas um cromossoma na fase final da fermentação está de acordo com os modelos propostos para o crescimento bacteriano. Depois de desenvolver esta nova técnica para a monitorização de bioprocessos, foram desenvolvidas outras técnicas para o estudo da fisiologia celular e estabilidade do plasmídeo durante a fermentação, uma vez que estes dois fatores estão intimamente relacionados. A análise da fisiologia celular, para além da análise do ciclo celular, englobou ainda a análise da viabilidade celular através de uma dupla marcação com iodeto de propídeo e bis-(1,3-ácido dibutilbarbitúrico)trimetina oxonol (BOX), que permitiu a análise de três populações distintas: células saudáveis (sem marcação), células com membrana despolarizada (marcação com bisoxonol) e células com membrana permeabilizada (marcação com iodeto de propídeo). Para a análise da estabilidade segregacional do plasmídeo foi desenvolvimento um método de PCR em tempo real que permitiu a avaliação do número de cópias de plasmídeo (PCN) por célula no decorrer da fermentação, usando um quantificação absoluta efetuada em células de E. coli previamente permeabilizadas. Após a implementação destas técnicas, foi estudado o impacto de diferentes estratégias de indução de DNA plasmídico na performance do bioprocesso. Devido às características da estirpe hospedeira e do plasmídeo utilizados para a otimização da produção, foi possível o estudo comparativo entre diversas estratégias de indução de pDNA como a adição de adenosina monofostafato (AMP), limitação de aminoácidos com ou sem adição de AMP, bem como a indução pela temperatura. Devido às alterações morfológicas previamente observadas pelo nosso grupo, um dos parâmetros avaliado foi a morfologia celular através da medição da dispersão de luz por citometria de fluxo. Esta análise permitiu, mais uma vez, verificar a existência de filamentação celular que terá ocorrido devido à amplificação de pDNA causada pelas diferentes estratégias de indução utilizadas. A análise da viabilidade celular por citometria de fluxo permitiu concluir que, no final da fermentação, a grande maioria das células ainda possuía membranas citoplasmáticas intactas e polarizadas, indicando que as condições utilizadas não terão causado nas células um elevado stress metabólico. Foi ainda estudado o ciclo celular durante a fermentação tendo em vista a obtenção de informações mais detalhadas sobre a heterogeneidade da população bacteriana e possíveis alterações fisiológicas causadas pela amplificação de pDNA. Esta análise da distribuição de DNA permitiu observar que, durante a fermentação, ocorreu um alargamento dos picos dos histogramas de DNA devido ao aumento da heterogeneidade da população, possivelmente como resultado da amplificação de pDNA verificada. Os resultados obtidos para a determinação de PCN demonstraram que as estratégias de indução tendo por base a limitação de aminoácidos permitiram a obtenção de valores de PCN mais elevados no final das fermentações, comparativamente à indução pelo aumento da temperatura. Os elevados valores de PCN obtidos no final das fermentações parecem sugerir que é na fase estacionária do crescimento que se verificam os valores máximos de amplificação do plasmídeo. Quanto à produção de DNA plasmídico, as produções específicas mais elevadas, expressas em mg pDNA por g de peso seco de células, foram obtidas nas fermentações em que foi utilizada a limitação de aminoácidos conjuntamente com a adição de AMP. A análise por eletroforese de agarose dos lisados alcalinos resultantes das fermentações confirmou, ainda, a integridade do pDNA, que se encontrava maioritariamente na conformação superenrolada, com pequenas quantidades da isoforma circular aberta e sem bandas visíveis de RNA. A última etapa deste trabalho consistiu no estudo da estratégia de fermentação mais adequada em bioreactor, a fim de aumentar a produtividade do processo. Para o efeito foram testadas fermentações em “batch” e “fed-batch”, variando as concentrações das fontes de carbono e azoto em “batch” e utilizando diferentes perfis de alimentação em “fed-batch”. Nas fermentações em “fed-batch”, o meio de alimentação foi adicionado segundo perfis prédeterminados exponenciais e constantes para obtenção de diferentes taxas de crescimento, sempre inferiores à taxa específica de crescimento máxima. Para além do estudo da influência das estratégias de fermentação na produção de pDNA, também foi estudado o impacto destas na viabilidade celular e na estabilidade segregacional do pDNA utilizando os métodos de monitorização já descritos anteriormente. Os resultados obtidos demonstraram que as produções de pDNA e biomassa mais elevadas foram obtidas nas fermentações em “fed-batch”, tendo os melhores resultados, em termos de biomassa e produção de pDNA, sido obtidos com uma alimentação exponencial com uma taxa de crescimento pré-determinada de 0.2 h-1. Em termos de estabilidade plasmídica, as fermentações em “batch” demonstraram menor instabilidade durante as fermentações, com um aumento do número de cópias de plasmídeo no início da fase estacionária das fermentações; enquanto as fermentações em “fed-batch” mostraram uma maior instabilidade segregacional, devido às constantes flutuações nos valores de PCN no decorrer das fermentações. Em relação à análise da fisiologia celular, também se verificou que a percentagem de células viáveis era mais elevada nas fermentações em “batch” e com uma menor heterogeneidade em termos de ciclo celular. Possivelmente, o prolongado tempo de fermentação, mesmo com a adição constante de nutrientes fez com que a percentagem de células viáveis em “fed-batch” fosse menor. Os resultados obtidos nestas experiências demonstraram que, no desenvolvimento de um bioprocesso de produção de pDNA, as decisões para a escolha do melhor processo não devem ser apenas baseadas na produção de pDNA, mas devem ter em conta outros fatores que possam levar a uma diminuição dos valores de produtividade, como o aumento do stress metabólico e da instabilidade plasmídica. A avaliação destes fatores permite aos investigadores uma visão mais detalhada sobre o bioprocesso em si, de forma a compreender e minimizar os efeitos nocivos destes dois fatores na produção e assim alcançar maiores rendimentos e reduzindo o custo do produto. Em suma, nesta tese pretendeu-se otimizar e avaliar de uma forma sistemática a produção do plasmídeo pVAX1-LacZ em Escherichia coli DH5 alfa, considerando que a fisiologia celular e a estabilidade plasmídica são dois fatores fulcrais a considerar para o desenvolvimento deste tipo de bioprocessos. Para o efeito foram desenvolvidas várias metodologias que permitiram a obtenção de um conhecimento mais alargado sobre o bioprocesso em si e sobre a melhor forma de atuar para aumentar a sua performance.
A terapia génica e as vacinas de DNA são abordagens promissoras para a prevenção e possível cura de doenças como cancro, infeções virais, como HIV e hepatite, doenças cardiovasculares, entre outras. Os constantes progressos no aumento da eficácia na transfecção de moléculas de DNA plasmídico (pDNA), faz com que este vetor não viral seja visto cada vez mais como um vetor viável para uso em terapia génica ou vacinação com DNA. Assim sendo, torna-se relevante a obtenção de elevadas quantidades de DNA plasmídico com elevado grau de pureza para ser posteriormente usado em aplicações terapêuticas. Para atingir este objetivo, é necessária a combinação entre a otimização das condições de crescimento para a produção de DNA plasmídico e a eficiência do processo de purificação. Apesar de, até à data, grande parte da pesquisa se ter focado no desenvolvimento do processo de purificação; o passo limitante do processo global continua a ser a produção de pDNA, que quando otimizada permite melhorar os processos de purificação subsequentes pela redução da fração de contaminantes (DNA genómico, RNA, proteínas e endotoxinas). A Food and Drug Administration (FDA) reconhece que as conformações circular aberta e linear são, terapeuticamente, menos eficazes que a conformação superenrolada. Assim, torna-se importante que, nos processos de purificação, se efetue a separação entre as outras isoformas e o plasmídeo superenrolado e, uma vez que esta operação pode ser bastante difícil durante a purificação, o processo de fermentação deve ser otimizado de modo a produzir uma elevada percentagem de plasmídeo na conformação superenrolada. O design e otimização de um processo de produção engloba múltiplas etapas de seleção tendo em vista a escolha do bioprocesso com o maior rendimento em termos de DNA plasmídico. A primeira etapa neste design é a escolha da estirpe hospedeira e do vetor a utilizar para a produção do plasmídeo contendo a sequência terapêutica de interesse. Apesar de já terem sido propostos outros microrganismos para produção recombinante de biomoléculas, a bactéria Escherichia coli continua a ser a mais utilizada para este fim. Atualmente, devido à constante evolução da biologia molecular e engenharia genética, encontra-se disponível uma grande variedade de estirpes recombinantes de E. coli e de vetores otimizados para a produção de DNA plasmídico. Para a produção de pDNA, as estirpes de E. coli usadas possuem, geralmente, mutações em genes de recombinação e de produção de endonucleases, proporcionando uma maior estabilidade do vetor. Em relação aos vetores, têm sido propostas novas estratégias para uma produção mais eficiente e para um aumento da segurança destes vetores, reduzindo os elementos procariotas e melhorando o controlo da integração da sequência terapêutica no genoma do hospedeiro. De entre estas novas estratégias destacamse os plasmídeos minicirculares, os plasmídeos de tamanho reduzido (MIDGE) e ainda a introdução do transposão “Sleeping Beauty”. Relativamente à produção de pDNA em Escherichia coli, existem dois fatores que podem influenciar consideravelmente o processo de produção: a estabilidade plasmídica e o stress metabólico imposto à estirpe hospedeira pela manutenção e replicação do plasmídeo. Estes dois fatores podem levar a uma diminuição da produtividade do processo devido ao aumento da instabilidade do plasmídeo a vários níveis (segregacional, estrutural e relativamente às isoformas) e a uma redução do crescimento da estirpe hospedeira devido a uma limitação da capacidade biossintética e produção de energia das células. Após uma seleção preliminar do sistema de expressão, tendo em conta todos os fatores já descritos, o passo seguinte consiste na formulação de um meio de cultura contendo os componentes apropriados, não só para o crescimento, como também para a produção de DNA plasmídico. Estes componentes incluem uma fonte de carbono, uma ou várias fonte(s) de azoto, um sistema tamponante, geralmente contendo fosfatos e vários elementos vestigiais (cálcio, ferro, molibdénio, entre outros). No caso particular da produção de pDNA, o meio de cultura também deve conter sulfato de magnésio, numa concentração de aproximadamente 80 mM, uma vez que este parece causar um aumento da produção da isoforma superenrolada. Após definição do meio de cultura, o próximo passo é a definição das condições de cultura, como pH, teor de oxigénio dissolvido e temperatura. A definição das condições de cultura não deve ser efetuada apenas tendo em conta a obtenção de elevadas quantidades de biomassa, mas também a produção de DNA plasmídico. Por exemplo, está descrito que temperaturas mais elevadas (37-42 ºC) e teores de oxigénio dissolvido mais baixos causam um aumento da produção de pDNA; contudo, estas mesmas condições também são responsáveis por uma diminuição do crescimento de E. coli, levando à produção de uma menor quantidade de biomassa. A otimização das condições de cultura, por si só, leva, geralmente, a um aumento da produção de pDNA. Todavia, têm sido propostas várias estratégias de indução de DNA plasmídico que poderão conduzir a maiores produtividades, uma vez que estas causam a amplificação seletiva de pDNA, aumentando o número de cópias de plasmídeo por célula e, por conseguinte, levam a um aumento da produção de pDNA com uma concomitante redução da quantidade de contaminantes para os processos subsequentes de purificação. Estas estratégias de indução incluem a adição de cloranfenicol e adenosina monofosfato (AMP), limitação de aminoácidos e aumento de temperatura. Após seleção de todos estes parâmetros, a transição para bioreactor torna necessária a escolha da estratégia de fermentação apropriada. De entre as estratégias de fermentação descritas para a produção de pDNA, nomeadamente “batch”, “fed-batch” e contínuo; a mais utilizada e descrita como aquela que possibilita uma maior produtividade de pDNA é a fermentação em modo “fedbatch”. A fermentação em “fed-batch” é a mais utilizada para a produção de pDNA uma vez que possibilita a obtenção de elevadas densidades óticas e baixa acumulação de produtos tóxicos resultantes do metabolismo como o acetato, por exemplo. Uma vez que há diversos fatores que podem influenciar um bioprocesso para produção de DNA plasmídico, torna-se necessário desenvolver novas metodologias e técnicas que forneçam uma análise do processo num espaço de tempo que permita ao investigador alterar o seu processo a fim de atingir uma maior produtividade. Tendo em consideração que o stress metabólico imposto pelo plasmídeo bem como a instabilidade plasmídica são potenciais fatores limitantes para um processo de produção de pDNA, o desenvolvimento de novas técnicas de monitorização, bem como a aplicação de técnicas já existentes, deve ter em conta a análise destes dois fatores. Estes métodos de monitorização, para além de serem utilizados para uma melhor compreensão da performance dos bioprocessos, também permitem a identificação de possíveis alvos para engenharia metabólica das estirpes e vetores a fim de reduzir o stress metabólico e a instabilidade plasmídica, conduzindo à obtenção de maiores produtividades, reduzindo assim o custo global do processo. Assim sendo, o principal objetivo desta tese foi a otimização da produção de DNA plasmídico em Escherichia coli, numa primeira fase em erlenmeyer e, posteriormente, em bioreactores de bancada. Primeiramente foi estudada a influência das condições de cultura na produção de pDNA, utilizando um meio de cultura semi-definido previamente desenvolvido pelo nosso grupo. Seguidamente, foram desenvolvidas novas metodologias para a análise da fisiologia celular do hospedeiro e estabilidade segregacional do plasmídeo, uma vez que o primeiro estudo evidenciou que as condições de cultura poderiam estar a influenciar o stress metabólico da célula e a estabilidade do plasmídeo. Após o desenvolvimento destas metodologias de citometria de fluxo e PCR em tempo real, a análise da fisiologia celular e estabilidade plasmídica foi aplicada a um estudo comparativo entre algumas das diferentes estratégias de indução de pDNA atualmente descritas. O objetivo final do trabalho consistiu na otimização da produção em bioreactor, estudando a influência de diferentes estratégias de fermentação na produção de pDNA, monitorizando a estabilidade plasmídica e a fisiologia celular ao longo do processo. No design deste bioprocesso para produção de pDNA, a primeira etapa do estudo consistiu, então, no desenvolvimento de um meio semi-definido contendo glicerol como fonte de carbono e triptona como fonte de azoto. Após o desenvolvimento do meio semi-definido, o nosso primeiro objetivo baseou-se no estudo da influência das condições de cultura, como a temperatura e a concentração de triptona, sobre o rendimento global de pDNA em erlenmeyer. Para os estudos de temperatura, as células foram cultivadas em diferentes temperaturas de crescimento: 30, 32, 37, 40 e 42 ºC. Este estudo revelou que as temperaturas mais elevadas causaram filamentação das células de E. coli. A análise de outros parâmetros relacionados com o crescimento celular, como a taxa específica de crescimento e a produção de biomassa, juntamente com a análise da produção de pDNA, revelaram baixas taxas de crescimento e uma menor produção de biomassa para as temperaturas mais elevadas. Estes resultados levantaram a hipótese de que a ocorrência de filamentação celular poderia ser devida a um aumento do stress metabólico imposto pela manutenção e replicação do plasmídeo na célula hospedeira. A obtenção de maiores rendimentos específicos de pDNA e graus de pureza para as temperaturas mais elevadas, facto este que pode ser interpretado como sinónimo da existência de um maior número de cópias do plasmídeo por célula hospedeira, pode ser vista como uma das causas para este aumento do stress metabólico da célula. Uma vez que tinha sido descrito que condições de limitação de aminoácidos causavam amplificação de pDNA em E. coli, o próximo passo consistiu no estudo da influência de concentrações limitantes (0.5, 1 e 3 g/L) e não limitantes (5 e 20 g/L) de triptona na produção de pDNA. Os resultados obtidos demonstraram que o uso de concentrações reduzidas de triptona levava a um aumento da produção específica de pDNA, demonstrando que a limitação de aminoácidos leva a uma amplificação de pDNA, o que está relacionado com o facto de a estirpe utilizada ser uma estirpe relA- . Devido aos resultados obtidos neste primeiro estudo, havia evidências de que a fisiologia celular seria um fator importante a ter em conta no desenvolvimento e otimização deste processo de produção de pDNA. Assim sendo, a próxima etapa deste trabalho consistiu no desenvolvimento e implementação de metodologias que permitissem uma avaliação da fisiologia celular tendo por base a citometria de fluxo. A escolha da citometria de fluxo como técnica de monitorização deveu-se, sobretudo, ao facto de possibilitar a análise de cada célula da população individualmente e fornecer uma elevada quantidade de dados de forma rápida permitindo, assim, uma análise em linha dos bioprocessos. Uma vez que a análise do DNA bacteriano é considerada uma mais-valia para o controlo de bioprocessos e como ainda não se encontram descritos muitos protocolos para esta análise aplicada a bioprocessos; de seguida, procedeu-se ao desenvolvimento e validação de um protocolo de citometria de fluxo para a monitorização do ciclo celular durante os processos de fermentação de Escherichia coli. Este protocolo foi desenvolvido utilizando o fluorocromo DRAQ5, uma vez que, devido às suas características espetrais, não necessita de um citómetro com laser ultra-violeta (UV) e permite ser conjugado com outros fluorocromos. Apesar de os resultados obtidos demonstrarem que o DRAQ5 era capaz de marcar células de E. coli vivas, devido aos baixos valores de fluorescência obtidos e ao facto de não ser possível o estudo do ciclo celular nestas condições, investigou-se a capacidade de análise do ciclo celular em células de E. coli fixadas com etanol ou glutaraldeído. Depois de determinar as condições de incubação adequadas, concentração de fluorocromo e agente fixante (etanol), as células de Escherichia coli não contendo plasmídeo foram cultivadas em meio semidefinido, a fim de avaliar a aplicabilidade do DRAQ5 para monitorizar o ciclo celular em fermentações bacterianas. Os resultados obtidos demonstraram que esta estirpe de E. coli, nas condições referidas, tem um ciclo celular em que alterna entre um e dois cromossomas e, também, o aumento da população de células com apenas um cromossoma na fase final da fermentação está de acordo com os modelos propostos para o crescimento bacteriano. Depois de desenvolver esta nova técnica para a monitorização de bioprocessos, foram desenvolvidas outras técnicas para o estudo da fisiologia celular e estabilidade do plasmídeo durante a fermentação, uma vez que estes dois fatores estão intimamente relacionados. A análise da fisiologia celular, para além da análise do ciclo celular, englobou ainda a análise da viabilidade celular através de uma dupla marcação com iodeto de propídeo e bis-(1,3-ácido dibutilbarbitúrico)trimetina oxonol (BOX), que permitiu a análise de três populações distintas: células saudáveis (sem marcação), células com membrana despolarizada (marcação com bisoxonol) e células com membrana permeabilizada (marcação com iodeto de propídeo). Para a análise da estabilidade segregacional do plasmídeo foi desenvolvimento um método de PCR em tempo real que permitiu a avaliação do número de cópias de plasmídeo (PCN) por célula no decorrer da fermentação, usando um quantificação absoluta efetuada em células de E. coli previamente permeabilizadas. Após a implementação destas técnicas, foi estudado o impacto de diferentes estratégias de indução de DNA plasmídico na performance do bioprocesso. Devido às características da estirpe hospedeira e do plasmídeo utilizados para a otimização da produção, foi possível o estudo comparativo entre diversas estratégias de indução de pDNA como a adição de adenosina monofostafato (AMP), limitação de aminoácidos com ou sem adição de AMP, bem como a indução pela temperatura. Devido às alterações morfológicas previamente observadas pelo nosso grupo, um dos parâmetros avaliado foi a morfologia celular através da medição da dispersão de luz por citometria de fluxo. Esta análise permitiu, mais uma vez, verificar a existência de filamentação celular que terá ocorrido devido à amplificação de pDNA causada pelas diferentes estratégias de indução utilizadas. A análise da viabilidade celular por citometria de fluxo permitiu concluir que, no final da fermentação, a grande maioria das células ainda possuía membranas citoplasmáticas intactas e polarizadas, indicando que as condições utilizadas não terão causado nas células um elevado stress metabólico. Foi ainda estudado o ciclo celular durante a fermentação tendo em vista a obtenção de informações mais detalhadas sobre a heterogeneidade da população bacteriana e possíveis alterações fisiológicas causadas pela amplificação de pDNA. Esta análise da distribuição de DNA permitiu observar que, durante a fermentação, ocorreu um alargamento dos picos dos histogramas de DNA devido ao aumento da heterogeneidade da população, possivelmente como resultado da amplificação de pDNA verificada. Os resultados obtidos para a determinação de PCN demonstraram que as estratégias de indução tendo por base a limitação de aminoácidos permitiram a obtenção de valores de PCN mais elevados no final das fermentações, comparativamente à indução pelo aumento da temperatura. Os elevados valores de PCN obtidos no final das fermentações parecem sugerir que é na fase estacionária do crescimento que se verificam os valores máximos de amplificação do plasmídeo. Quanto à produção de DNA plasmídico, as produções específicas mais elevadas, expressas em mg pDNA por g de peso seco de células, foram obtidas nas fermentações em que foi utilizada a limitação de aminoácidos conjuntamente com a adição de AMP. A análise por eletroforese de agarose dos lisados alcalinos resultantes das fermentações confirmou, ainda, a integridade do pDNA, que se encontrava maioritariamente na conformação superenrolada, com pequenas quantidades da isoforma circular aberta e sem bandas visíveis de RNA. A última etapa deste trabalho consistiu no estudo da estratégia de fermentação mais adequada em bioreactor, a fim de aumentar a produtividade do processo. Para o efeito foram testadas fermentações em “batch” e “fed-batch”, variando as concentrações das fontes de carbono e azoto em “batch” e utilizando diferentes perfis de alimentação em “fed-batch”. Nas fermentações em “fed-batch”, o meio de alimentação foi adicionado segundo perfis prédeterminados exponenciais e constantes para obtenção de diferentes taxas de crescimento, sempre inferiores à taxa específica de crescimento máxima. Para além do estudo da influência das estratégias de fermentação na produção de pDNA, também foi estudado o impacto destas na viabilidade celular e na estabilidade segregacional do pDNA utilizando os métodos de monitorização já descritos anteriormente. Os resultados obtidos demonstraram que as produções de pDNA e biomassa mais elevadas foram obtidas nas fermentações em “fed-batch”, tendo os melhores resultados, em termos de biomassa e produção de pDNA, sido obtidos com uma alimentação exponencial com uma taxa de crescimento pré-determinada de 0.2 h-1. Em termos de estabilidade plasmídica, as fermentações em “batch” demonstraram menor instabilidade durante as fermentações, com um aumento do número de cópias de plasmídeo no início da fase estacionária das fermentações; enquanto as fermentações em “fed-batch” mostraram uma maior instabilidade segregacional, devido às constantes flutuações nos valores de PCN no decorrer das fermentações. Em relação à análise da fisiologia celular, também se verificou que a percentagem de células viáveis era mais elevada nas fermentações em “batch” e com uma menor heterogeneidade em termos de ciclo celular. Possivelmente, o prolongado tempo de fermentação, mesmo com a adição constante de nutrientes fez com que a percentagem de células viáveis em “fed-batch” fosse menor. Os resultados obtidos nestas experiências demonstraram que, no desenvolvimento de um bioprocesso de produção de pDNA, as decisões para a escolha do melhor processo não devem ser apenas baseadas na produção de pDNA, mas devem ter em conta outros fatores que possam levar a uma diminuição dos valores de produtividade, como o aumento do stress metabólico e da instabilidade plasmídica. A avaliação destes fatores permite aos investigadores uma visão mais detalhada sobre o bioprocesso em si, de forma a compreender e minimizar os efeitos nocivos destes dois fatores na produção e assim alcançar maiores rendimentos e reduzindo o custo do produto. Em suma, nesta tese pretendeu-se otimizar e avaliar de uma forma sistemática a produção do plasmídeo pVAX1-LacZ em Escherichia coli DH5 alfa, considerando que a fisiologia celular e a estabilidade plasmídica são dois fatores fulcrais a considerar para o desenvolvimento deste tipo de bioprocessos. Para o efeito foram desenvolvidas várias metodologias que permitiram a obtenção de um conhecimento mais alargado sobre o bioprocesso em si e sobre a melhor forma de atuar para aumentar a sua performance.
Descrição
Palavras-chave
DNA plasmídico Escherichia coli