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Publicação
Relationship between the adenosine A1 receptor and cGMP levels in the hippocampus: implications on neurotransmission and synaptic plasticity
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Orientador(es)
Resumo(s)
The cyclic nucleotides cAMP and cGMP are second messengers whose levels are modulated by G proteins-coupled receptors, and regulate multiple brain functions, including neurotransmission, memory and synaptic plasticity. The adenosine A1 receptor is highly expressed in the hippocampus where it inhibits neurotransmitter release, protects against excitotoxic insults and regulates synaptic plasticity. Adenosine A1 receptor is coupled to Gi/o proteins which negatively regulate adenylyl cyclase and thus cAMP formation. Modulation of cGMP levels by Gi/o proteins-coupled receptors has also been recently reported. In the present work the ability of adenosine A1 receptors to regulate cyclic nucleotides levels in the hippocampus was investigated. The role of cyclic nucleotides as mediators of some actions of adenosine A1 receptor in the hippocampus was also studied. Activation of adenosine A1 receptor has been shown to decrease cAMP formation in the cerebral cortex, but its effect on cAMP levels at the hippocampus is not clarified, nor its interaction with others neuromodulators while regulating cAMP levels. We set forth to determine the type of interaction found between adenosine A1 and cannabinoids CB1 receptors as negative modulators of cAMP accumulation. Furthermore, we also intend to explore their combined neuroprotective potential. Quantification of cAMP in hippocampal slices was performed through an enzymatic immunoassay, while neuroprotection against NMDA-induced toxicity was assessed by determination of released LDH activity and by quantification, by fluorescence microscopy, of the uptake of propidium iodide (PI) in cultured organotypical hippocampal slices. The A1 agonist N6-Cyclopentyladenosine (CPA) decreased forskolin-stimulated cAMP accumulation in the hippocampal slice with an EC50 of 35 ± 19 nM and an Emax of 29% ± 5%, whereas for the CB1 agonist, WIN55212-2, an EC50 of 6.6 ± 2.7 μM and an Emax of 31% ± 2% were obtained. NMDA (50 μM) increased the release of LDH activity by 92% ± 4% (n=4) when compared with control. Application of WIN55212-2 (30 μM) decreased NMDA-induced LDH activity by 53% ± 11% (n=4), while CPA (100 nM) decreased it by 37% ± 11% (n=4). The combined inhibitory effect of WIN55212-2 (30 μM) and CPA (100 nM) on cAMP accumulation (41% ± 6%, n=4) and NMDA-induced LDH release (88% ± 14%, n=4) did not differ from the sum of the individual inhibitory effects of each agonist (43% ± 8%, n=4, for cAMP accumulation and 90 % ± 22%, n=4, for LDH release), but was different from the effects of CPA or WIN55212-2 alone. Similarly, an additive inhibitory effect of co-application of WIN55212-2 (30μM) and CPA (100nM) on NMDA (50μM)-induced PI uptake was also observed in CA3 but not in CA1 area of the hippocampal slice. Thus, the combined effect of CB1 and A1 agonists on cAMP accumulation and NMDA-induced neurotoxicity is additive suggesting that both agonists trigger independent cAMP signalling pathways and produce independent cumulative neuroprotection against excitotoxic insults in the hippocampus. Previous studies indicate that cGMP produces similar effects to those triggered by adenosine A1 receptors and, recently, it was reported that cGMP might mediate some actions of adenosine A1 receptor in the peripheral nervous system. However, the role of cGMP on adenosine A1 receptor mediated activity at the central nervous system remains obscure. Our aim was to clarify if cGMP is modulated by A1 receptors at the hippocampus, if this modulation depends on activation of the soluble form of guanylyl cyclase, and if such mechanism is identical between male and female rats. Furthermore, the role of cGMP in mediating the inhibitory effect of adenosine A1 receptor on neurotransmission in the hippocampus was also investigated. To achieve our objectives, we used two approaches, enzymatic immunoassays to measure cGMP accumulation and extracellular electrophysiology to measure synaptic transmission at the rat hippocampal slice. The enzymatic immunoassays tests reveal that application of CPA increased cGMP accumulation with an EC50 of 4.2 ± 1.4 nM and an Emax of 17% ± 0.9%. Furthermore, in male rats, the presence of sodium nitroprosside (SNP, a nitric oxide donor) abolished the effect of CPA on cGMP accumulation. In contrast, in female rats, SNP failed to modify the increase in cGMP accumulation induced by CPA, but this increase was reversed by DPCPX, stressing that A1 receptors modulate cGMP accumulation despite the increase in soluble guanylyl cyclase activity by SNP. Thus, A1 receptors increase intracellular cGMP levels at the hippocampus, through mechanisms which differ according to gender. Regarding extracellular electrophysiology studies, we investigated in what extent blocking the cGMP pathway using nitric oxide synthase (NOS), protein kinase G (PKG) and soluble guanylyl cyclase (sGC) inhibitors, would interfere with the inhibitory effect of CPA on synaptic transmission. CPA (15 nM) alone reversibly decreased synaptic transmission by 48% ± 2.1% (n=5) in males and by 54 % ± 5 % in females (n=5). In the presence of the NOS inhibitor LNAME (300 μM), the sGC antagonist ODQ (10 μM) and the PKG inhibitor KT5823 (1 nM), CPAinduced inhibition of synaptic transmission was dampened by 57 % ± 9 % (n=5), 23 % ± 7 % (n=4) and 49 % ± 9 % (n=4), respectively. This attenuation of the effect of CPA was similar in males and females. These findings suggest that A1 receptor neuromodulatory activity on synaptic transmission partially depends on the cGMP pathway.
Os nucleótidos cíclicos cAMP e cGMP são segundos mensageiros intracelulares cujos níveis são modulados por recetores acoplados a proteínas G, e regulam diversas funções cerebrais, incluindo neurotransmissão, memória e plasticidade sináptica. O cAMP ativa diretamente a cinase A de proteína (PKA), o seu principal efetor, regulando a libertação de neurotransmissores através da ativação de canais de Ca2+ ou inativação de canais de K+ . O cAMP também está implicado na regulação da memória e plasticidade sináptica no hipocampo por meio de ativação direta de EPACs (proteínas permutadoras ativadas pelo cAMP) e através da ativação do CREB (proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP) mediada pela PKA. O sinal de cAMP é transitório sendo regulado através da ação concertada da ciclase do adenililo e de fosfodiesterases dos nucleótidos cíclicos (PDEs). O cGMP é produzido por duas vias distintas. Uma envolve a ciclase do guanililo solúvel citoplasmática (sGC) cujo agonista, o óxido nítrico (NO), é produzido por ação da sintase do NO (NOS), a qual é ativada pelo cálcio, enquanto a outra envolve a ciclase do guanililo particulada ligada à membrana, a qual é activada por péptidos natriuréticos. A cinase G de proteína (PKG) é o principal efetor direto do cGMP, mediando a maior parte dos efeitos deste no sistema nervoso. O recetor A1 da adenosina é expresso em abundância no hipocampo onde medeia muitas das ações da adenosina extracelular, como a inibição da libertação de neurotransmissores, proteção contra insultos excitotóxicos e regulação da plasticidade sináptica. O recetor A1 da adenosina está acoplado a proteínas Gi/o que regulam negativamente a ciclase do adenililo (AC) e consequentemente a formação de cAMP. Além de inibir a AC, o recetor A1 também inibe canais de cálcio do tipo P/Q, ativa canais de potássio e regula a formação de fosfatos de inositol. A modulação dos níveis de cGMP através de recetores acoplados a proteínas Gi/o também foi recentemente referida. Neste trabalho foi investigada a capacidade dos recetores A1 da adenosina para regular os níveis de nucleótidos cíclicos no hipocampo. O papel dos nucleótidos cíclicos como mediadores de algumas das ações dos recetores A1 da adenosina também foi estudado. Foi anteriormente demostrado que a ativação dos recetores A1 da adenosina diminui a formação de cAMP no córtex cerebral, mas o seu efeito nos níveis de cAMP no hipocampo não está clarificado, nem a sua interação com outros neuromoduladores enquanto reguladores dos níveis de cAMP. Pretendeu-se então determinar o tipo de interação entre os recetores A1 da adenosina e CB1 dos canabinóides como moduladores negativos da acumulação de cAMP. Para além disso, o potencial neuroprotetor combinado dos dois recetores foi também investigado. A quantificação dos níveis de cAMP em fatias de hipocampo foi efetuada através de um ensaio imunoenzimático, e a neuroprotecção contra a toxicidade induzida por N-metil-D-aspartato (NMDA) foi quantificada através da medição colorimétrica da atividade da desidrogenase do lactato (LDH) libertada e da quantificação, por microscopia de fluorescência, da captação de iodeto de propídio (IP) em culturas organotípicas de fatias de hipocampo. A N6 - Ciclopentiladenosina (CPA), agonista seletivo dos recetores A1 da adenosina, diminuiu a acumulação de cAMP estimulada pela forscolina em fatias de hipocampo, com um EC50 de 35 ± 19 nM e um Emax de 29% ± 5%, enquanto que para o agonista CB1, WIN55212-2, foram obtidos um EC50 de 6,6 ± 2,7 µM e um Emax de 31% ± 2%. Quer o efeito da CPA quer o efeito do WIN55212-2 foram revertidos na presença de DPCPX (um antagonista seletivo dos recetores A1) e de AM251 (antagonista seletivo dos recetores CB1), respetivamente. O NMDA (50µM) aumentou a atividade da LDH libertada em 92% ± 4% (n=4) quando comparada com o controlo. A aplicação de WIN55212-2 (30 μM) diminuiu a atividade da LDH induzida por NMDA em 53% ± 11% (n=4), enquanto a CPA (100 nM) diminuiu-a em 37% ± 11% (n=4). O efeito inibitório combinado do WIN55212-2 (30 μM) e da CPA (100 nM) na acumulação de cAMP (41% ± 6%, n=4) e na atividade da LDH induzida pelo NMDA (88% ± 14%, n=4) não foi diferente da soma dos efeitos inibitórios individuais de cada agonista (43% ± 8%, n=4, para a acumulação do cAMP e 90 % ± 22%, n=4, para a libertação de LDH), mas foi diferente do efeito da CPA e do WIN55212-2 quando aplicados sozinhos. Similarmente, um efeito inibitório aditivo da coaplicação de WIN 55212-2 (30 uM) e CPA (100 nM) na captação de IP induzida pelo NMDA (50 uM), foi observado na região CA3 mas não na região CA1 da fatia de hipocampo. Assim, o efeito combinado de agonistas CB1 e A1 na acumulação de cAMP e na neurotoxicidade induzida pelo NMDA mostrou ser aditivo, sugerindo que ambos os agonistas desencadeiam vias de sinalização independentes associadas ao cAMP, e produzem neuroprotecção cumulativa independente face a insultos excitotóxicos no hipocampo. Estudos prévios indicam que o cGMP produz efeitos similares aos dos recetores A1 da adenosina e recentemente foi referido que o cGMP pode mediar algumas das ações dos recetores A1 da adenosina no sistema nervoso periférico. No entanto, o papel do cGMP na atividade mediada pelos recetores A1 da adenosina no sistema nervoso central permanece obscuro. No presente projeto, pretendeu-se investigar se o cGMP é modulado pelos recetores A1 da adenosina no hipocampo, se essa modulação depende da ativação da ciclase do guanililo solúvel, e se esse mecanismo de modulação é idêntico entre ratos machos e fêmeas. Para além disso, também se investigou o papel do cGMP no efeito inibitório do recetor A1 da adenosina na neurotransmissão no hipocampo. Para atingirmos os nossos objetivos, utilizámos duas abordagens experimentais: realização de ensaios imunoenzimáticos para medir a acumulação de cGMP e recurso a eletrofisiologia extracelular para medir a transmissão sináptica na fatia de hipocampo de rato. Os ensaios imunoenzimáticos revelaram que a aplicação de CPA aumentou a acumulação de cGMP com um EC50 de 4,2 ± 1,4 nM e um Emax de 17% ± 0,9%. Por outro lado, em ratos machos a presença de um dador de NO, o nitroprosseto de sódio (SNP), aboliu o efeito da CPA na acumulação de cGMP. Em contraste, em ratos fêmeas, o SNP não modificou o aumento na acumulação de cGMP induzido pela CPA, no entanto este aumento foi revertido pelo DPCPX, indicando que os recetores A1 modulam a acumulação de cGMP mesmo quando a atividade da ciclase do guanililo solúvel é aumentada pelo SNP. Portanto, os recetores A1 aumentam os níveis intracelulares de cGMP no hipocampo, através de mecanismos que dependem do sexo. Em relação aos estudos de eletrofisiologia extracelular, investigámos se o bloqueio de componentes da via do cGMP, através do uso de inibidores da NOS, da PKG e da sGC, interferiria com o efeito inibitório da CPA na transmissão sináptica. A CPA (15 nM) diminuiu de uma forma reversível a transmissão sináptica em 48% ± 2,1% (n=5) nos machos e em 54 % ± 5 % nas fêmeas (n=5). Na presença de L-NAME (300 μM, um inibidor da NOS), da ODQ (10 μM, um antagonista da sGC) e do KT5823 (1 nM, um inibidor da PKG), a inibição da transmissão sináptica pela CPA foi atenuada em 57 % ± 9 % (n=5), 23 % ± 7 % (n=4) e 49 % ± 9 % (n=4), respetivamente. Esta atenuação do efeito da CPA foi similar em machos e fêmeas. Estes resultados sugerem que a atividade neuromodulatória do recetor A1 na transmissão sináptica depende parcialmente da via do cGMP.
Os nucleótidos cíclicos cAMP e cGMP são segundos mensageiros intracelulares cujos níveis são modulados por recetores acoplados a proteínas G, e regulam diversas funções cerebrais, incluindo neurotransmissão, memória e plasticidade sináptica. O cAMP ativa diretamente a cinase A de proteína (PKA), o seu principal efetor, regulando a libertação de neurotransmissores através da ativação de canais de Ca2+ ou inativação de canais de K+ . O cAMP também está implicado na regulação da memória e plasticidade sináptica no hipocampo por meio de ativação direta de EPACs (proteínas permutadoras ativadas pelo cAMP) e através da ativação do CREB (proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP) mediada pela PKA. O sinal de cAMP é transitório sendo regulado através da ação concertada da ciclase do adenililo e de fosfodiesterases dos nucleótidos cíclicos (PDEs). O cGMP é produzido por duas vias distintas. Uma envolve a ciclase do guanililo solúvel citoplasmática (sGC) cujo agonista, o óxido nítrico (NO), é produzido por ação da sintase do NO (NOS), a qual é ativada pelo cálcio, enquanto a outra envolve a ciclase do guanililo particulada ligada à membrana, a qual é activada por péptidos natriuréticos. A cinase G de proteína (PKG) é o principal efetor direto do cGMP, mediando a maior parte dos efeitos deste no sistema nervoso. O recetor A1 da adenosina é expresso em abundância no hipocampo onde medeia muitas das ações da adenosina extracelular, como a inibição da libertação de neurotransmissores, proteção contra insultos excitotóxicos e regulação da plasticidade sináptica. O recetor A1 da adenosina está acoplado a proteínas Gi/o que regulam negativamente a ciclase do adenililo (AC) e consequentemente a formação de cAMP. Além de inibir a AC, o recetor A1 também inibe canais de cálcio do tipo P/Q, ativa canais de potássio e regula a formação de fosfatos de inositol. A modulação dos níveis de cGMP através de recetores acoplados a proteínas Gi/o também foi recentemente referida. Neste trabalho foi investigada a capacidade dos recetores A1 da adenosina para regular os níveis de nucleótidos cíclicos no hipocampo. O papel dos nucleótidos cíclicos como mediadores de algumas das ações dos recetores A1 da adenosina também foi estudado. Foi anteriormente demostrado que a ativação dos recetores A1 da adenosina diminui a formação de cAMP no córtex cerebral, mas o seu efeito nos níveis de cAMP no hipocampo não está clarificado, nem a sua interação com outros neuromoduladores enquanto reguladores dos níveis de cAMP. Pretendeu-se então determinar o tipo de interação entre os recetores A1 da adenosina e CB1 dos canabinóides como moduladores negativos da acumulação de cAMP. Para além disso, o potencial neuroprotetor combinado dos dois recetores foi também investigado. A quantificação dos níveis de cAMP em fatias de hipocampo foi efetuada através de um ensaio imunoenzimático, e a neuroprotecção contra a toxicidade induzida por N-metil-D-aspartato (NMDA) foi quantificada através da medição colorimétrica da atividade da desidrogenase do lactato (LDH) libertada e da quantificação, por microscopia de fluorescência, da captação de iodeto de propídio (IP) em culturas organotípicas de fatias de hipocampo. A N6 - Ciclopentiladenosina (CPA), agonista seletivo dos recetores A1 da adenosina, diminuiu a acumulação de cAMP estimulada pela forscolina em fatias de hipocampo, com um EC50 de 35 ± 19 nM e um Emax de 29% ± 5%, enquanto que para o agonista CB1, WIN55212-2, foram obtidos um EC50 de 6,6 ± 2,7 µM e um Emax de 31% ± 2%. Quer o efeito da CPA quer o efeito do WIN55212-2 foram revertidos na presença de DPCPX (um antagonista seletivo dos recetores A1) e de AM251 (antagonista seletivo dos recetores CB1), respetivamente. O NMDA (50µM) aumentou a atividade da LDH libertada em 92% ± 4% (n=4) quando comparada com o controlo. A aplicação de WIN55212-2 (30 μM) diminuiu a atividade da LDH induzida por NMDA em 53% ± 11% (n=4), enquanto a CPA (100 nM) diminuiu-a em 37% ± 11% (n=4). O efeito inibitório combinado do WIN55212-2 (30 μM) e da CPA (100 nM) na acumulação de cAMP (41% ± 6%, n=4) e na atividade da LDH induzida pelo NMDA (88% ± 14%, n=4) não foi diferente da soma dos efeitos inibitórios individuais de cada agonista (43% ± 8%, n=4, para a acumulação do cAMP e 90 % ± 22%, n=4, para a libertação de LDH), mas foi diferente do efeito da CPA e do WIN55212-2 quando aplicados sozinhos. Similarmente, um efeito inibitório aditivo da coaplicação de WIN 55212-2 (30 uM) e CPA (100 nM) na captação de IP induzida pelo NMDA (50 uM), foi observado na região CA3 mas não na região CA1 da fatia de hipocampo. Assim, o efeito combinado de agonistas CB1 e A1 na acumulação de cAMP e na neurotoxicidade induzida pelo NMDA mostrou ser aditivo, sugerindo que ambos os agonistas desencadeiam vias de sinalização independentes associadas ao cAMP, e produzem neuroprotecção cumulativa independente face a insultos excitotóxicos no hipocampo. Estudos prévios indicam que o cGMP produz efeitos similares aos dos recetores A1 da adenosina e recentemente foi referido que o cGMP pode mediar algumas das ações dos recetores A1 da adenosina no sistema nervoso periférico. No entanto, o papel do cGMP na atividade mediada pelos recetores A1 da adenosina no sistema nervoso central permanece obscuro. No presente projeto, pretendeu-se investigar se o cGMP é modulado pelos recetores A1 da adenosina no hipocampo, se essa modulação depende da ativação da ciclase do guanililo solúvel, e se esse mecanismo de modulação é idêntico entre ratos machos e fêmeas. Para além disso, também se investigou o papel do cGMP no efeito inibitório do recetor A1 da adenosina na neurotransmissão no hipocampo. Para atingirmos os nossos objetivos, utilizámos duas abordagens experimentais: realização de ensaios imunoenzimáticos para medir a acumulação de cGMP e recurso a eletrofisiologia extracelular para medir a transmissão sináptica na fatia de hipocampo de rato. Os ensaios imunoenzimáticos revelaram que a aplicação de CPA aumentou a acumulação de cGMP com um EC50 de 4,2 ± 1,4 nM e um Emax de 17% ± 0,9%. Por outro lado, em ratos machos a presença de um dador de NO, o nitroprosseto de sódio (SNP), aboliu o efeito da CPA na acumulação de cGMP. Em contraste, em ratos fêmeas, o SNP não modificou o aumento na acumulação de cGMP induzido pela CPA, no entanto este aumento foi revertido pelo DPCPX, indicando que os recetores A1 modulam a acumulação de cGMP mesmo quando a atividade da ciclase do guanililo solúvel é aumentada pelo SNP. Portanto, os recetores A1 aumentam os níveis intracelulares de cGMP no hipocampo, através de mecanismos que dependem do sexo. Em relação aos estudos de eletrofisiologia extracelular, investigámos se o bloqueio de componentes da via do cGMP, através do uso de inibidores da NOS, da PKG e da sGC, interferiria com o efeito inibitório da CPA na transmissão sináptica. A CPA (15 nM) diminuiu de uma forma reversível a transmissão sináptica em 48% ± 2,1% (n=5) nos machos e em 54 % ± 5 % nas fêmeas (n=5). Na presença de L-NAME (300 μM, um inibidor da NOS), da ODQ (10 μM, um antagonista da sGC) e do KT5823 (1 nM, um inibidor da PKG), a inibição da transmissão sináptica pela CPA foi atenuada em 57 % ± 9 % (n=5), 23 % ± 7 % (n=4) e 49 % ± 9 % (n=4), respetivamente. Esta atenuação do efeito da CPA foi similar em machos e fêmeas. Estes resultados sugerem que a atividade neuromodulatória do recetor A1 na transmissão sináptica depende parcialmente da via do cGMP.
Descrição
Palavras-chave
Hipocampo - Plasticidade sináptica Transmissão sináptica Neurotransmissão Neuroprotecção Receptor A1 da adenosina