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Authors
Abstract(s)
Stroke is the leading cause of death and adult disability in Portugal and the second cause of death worldwide. In the coming years, this health condition will worsen due to the increase in average life expectancy and the increase in the number of individuals with risk factors for stroke. Currently, the recommended treatment for stroke patients is the intravenous thrombolysis therapy (with alteplase or endovascular thrombectomy), although it has limited efficacy due to the narrow therapeutic window where it can be applied without causing hemorrhagic transformations, limiting the benefit to many patients and highlighting the need to develop alternative and safer therapies. The development of strategies aiming to potentiate endogenous neuroprotective mechanisms has emerged as a safe alternative to thrombolysis, however, these approaches have undervalued the importance of the cerebral vasculature in the post-stroke recovery. Previously, it was demonstrated that cerebral vascular remodeling is correlated with higher survival rates and improved long-term neurological function in stroke patients. Accordingly, in this research work, it was proposed the modulation of the Argonaute (Ago)-2 endogenous mechanism to enhance the brain vascular function compromised by cerebral ischemia and, consequently, contributing to full parenchymal recovery after a stroke. Besides being the major coordinator of microRNA traffic and activity, Ago2 protein is pivotal for cell survival and tube network formation in peripheral endothelial cells. However, these mechanisms and the role of Ago2 in the ischemic brain vasculature remain unknown. In this sense, the potential of this protein in the inflammatory process was first assessed. This pathological process is one of the most important post-stroke pathological events that can lead to short-term mortality or promote long-term disability. Accordingly, in vitro (mouse primary brain cultures of endothelial and glial cells stimulated with lipopolysaccharide) and in vivo (adult mice intraperitoneally injected with lipopolysaccharide) data revealed that exogenous Ago2 application (downregulated in brain vasculature in these conditions) normalized endothelial markers associated with inflammatory-induced damage which, in turn, reestablished previously compromised glial and neuronal function. Then, after confirming the potential of Ago2 for cerebral ischemia studies, a strategy to enhance the Ago2 intracellular levels (also downregulated in the ischemic context) and to promote endothelial cell survival was defined. The controlled release of retinoic acid (a signaling molecule with defined anti-inflammatory and pro-angiogenic properties) via polymeric nanoparticles arose as a promising approach. In vitro data (mouse primary brain cultures of endothelial cells subjected to oxygen and glucose deprivation) revealed the protective potential of RA-NP in ischemic conditions, only observed by restoring basal levels of Ago2 protein (an effect mediated by the nitric oxide signaling), highlighting the importance of Ago2 in vascular function. Additionally, in vivo data (adult mice subjected to transient occlusion of the middle cerebral artery) showed that the systemic administration of this formulation promoted tissue survival, normalized inflammatory response, and promoted neurovascular repair (with a robust pro-angiogenic effect) in the peri-infarct region after stroke. However, further studies are needed to establish a correlation between the observed in vivo outcome and the Ago2 protein, and of RA-NP treatment and to decipher interactions between this protein and retinoic acid. Altogether, the experimental research developed throughout this Thesis provided evidence that the modulation of the Ago2 endogenous mechanism can be envisioned as a neuroprotective approach in post-stroke recovery. Furthermore, it revealed a safe nanotechnological tool able to modulate this system, suitable for intravenous administration, and compatible with pre-existing therapies.
O acidente vascular cerebral (AVC) é a principal causa de morte e incapacidade em adultos em Portugal e a segunda causa de morte em todo o mundo. Nos próximos anos, estima-se um agravamento desta condição de saúde como resultado do aumento da esperança média de vida e com o aumento de indivíduos que apresentam fatores de risco para o AVC. Atualmente, a trombólise intravenosa (através da administração de alteplase ou da trombectomia endovascular) é o tratamento preconizado para os doentes com AVC, apesar de apresentar eficácia limitada devido à estreita janela terapêutica onde pode ser usada sem causar transformações hemorrágicas, limitando o benefício a muitos doentes e destacando a necessidade de se desenvolverem terapias alternativas e mais seguras. O desenvolvimento de estratégias destinadas a potenciar os mecanismos neuroprotetores endógenos surgiu como uma alternativa segura à trombólise, no entanto, estas abordagens têm subestimado a importância da vasculatura cerebral na recuperação após um AVC. Anteriormente, foi demonstrado que a remodelação vascular cerebral está correlacionada com maiores taxas de sobrevivência e melhoria da função neurológica a longo prazo em pacientes que sofreram um AVC. Assim, neste trabalho de investigação, foi proposta a modulação de um mecanismo endógeno, a Argonauta (Ago)-2, para recuperar a função vascular cerebral comprometida após isquémia cerebral e, consequentemente, contribuir para uma recuperação do parênquima cerebral após um AVC. Para além de coordenar o tráfego e a atividade dos microRNA, a proteína Ago2 é essencial para assegurar a sobrevivência celular e a formação de túbulos capilares em células endoteliais periféricas. No entanto, estes mecanismos e o papel da Ago2 no endotélio cerebral isquémico ainda permanecem desconhecidos. Neste sentido, foi aferido, em primeiro lugar, o potencial desta proteína no processo inflamatório, considerado um dos eventos patológicos mais importantes que ocorre após o AVC e que pode levar à mortalidade a curto prazo ou promover a incapacidade a longo prazo do paciente. Os dados in vitro (em culturas primárias de células endoteliais e gliais do cérebro de murganho estimuladas com lipopolissacarídeo) e in vivo (em murganhos adultos injetados intraperitonealmente com lipopolissacarídeo) revelaram que a aplicação exógena da Ago2, sub-expressa pela vasculatura cerebral neste contexto patológico, normalizou marcadores endoteliais associados ao dano induzido pelo processo inflamatório e que, por sua vez, restabeleceu a função glial e neuronal previamente comprometidas. Em seguida, e tendo aferido o potencial da Ago2 para os estudos em contexto de isquémia cerebral, foi definida uma estratégia que promovesse o aumento dos níveis intracelulares desta proteína (também sub-expressa em contexto isquémico) e a sobrevivência endotelial. A entrega controlada de ácido retinóico (uma molécula sinalizadora com propriedades anti-inflamatórias e pró-angiogénicas) através de nanopartículas poliméricas (RA-NP) foi a estratégia definida. Os dados in vitro (em culturas primárias de células endoteliais do cérebro de murganho privadas de oxigénio e glucose) revelaram o potencial protetor das RA-NP em condições isquémicas, apenas observado pela reposição dos níveis basais da proteína Ago2 (um efeito mediado pela via do óxido nítrico), comprovando, uma vez mais, a importância desta proteína na função vascular. Adicionalmente, os dados in vivo (murganhos adultos sujeitos à oclusão transitória da artéria cerebral média) mostraram que a administração sistémica das RA-NP promoveu a sobrevivência do tecido lesado, normalizou a resposta inflamatória e promoveu a reparação neurovascular (com um efeito pró-angiogénico robusto) na região de penumbra durante a isquémia cerebral. No entanto, mais estudos são necessários para estabelecer uma correlação entre o resultado observado in vivo e a proteína Ago2 e para se desvendar as interações desta proteína com o ácido retinóico. Em suma, o trabalho experimental desenvolvido ao longo desta tese forneceu evidências de que a modulação do mecanismo endógeno Ago2 pode ser considerada uma abordagem neuroprotetora, com grande potencial terapêutico na recuperação após o AVC. Para além disso, revelou uma ferramenta nanotecnológica capaz de modular este sistema e, com potencial para ser usada, em conjunto com terapias já existentes, a nível sistémico de forma segura.
O acidente vascular cerebral (AVC) é a principal causa de morte e incapacidade em adultos em Portugal e a segunda causa de morte em todo o mundo. Nos próximos anos, estima-se um agravamento desta condição de saúde como resultado do aumento da esperança média de vida e com o aumento de indivíduos que apresentam fatores de risco para o AVC. Atualmente, a trombólise intravenosa (através da administração de alteplase ou da trombectomia endovascular) é o tratamento preconizado para os doentes com AVC, apesar de apresentar eficácia limitada devido à estreita janela terapêutica onde pode ser usada sem causar transformações hemorrágicas, limitando o benefício a muitos doentes e destacando a necessidade de se desenvolverem terapias alternativas e mais seguras. O desenvolvimento de estratégias destinadas a potenciar os mecanismos neuroprotetores endógenos surgiu como uma alternativa segura à trombólise, no entanto, estas abordagens têm subestimado a importância da vasculatura cerebral na recuperação após um AVC. Anteriormente, foi demonstrado que a remodelação vascular cerebral está correlacionada com maiores taxas de sobrevivência e melhoria da função neurológica a longo prazo em pacientes que sofreram um AVC. Assim, neste trabalho de investigação, foi proposta a modulação de um mecanismo endógeno, a Argonauta (Ago)-2, para recuperar a função vascular cerebral comprometida após isquémia cerebral e, consequentemente, contribuir para uma recuperação do parênquima cerebral após um AVC. Para além de coordenar o tráfego e a atividade dos microRNA, a proteína Ago2 é essencial para assegurar a sobrevivência celular e a formação de túbulos capilares em células endoteliais periféricas. No entanto, estes mecanismos e o papel da Ago2 no endotélio cerebral isquémico ainda permanecem desconhecidos. Neste sentido, foi aferido, em primeiro lugar, o potencial desta proteína no processo inflamatório, considerado um dos eventos patológicos mais importantes que ocorre após o AVC e que pode levar à mortalidade a curto prazo ou promover a incapacidade a longo prazo do paciente. Os dados in vitro (em culturas primárias de células endoteliais e gliais do cérebro de murganho estimuladas com lipopolissacarídeo) e in vivo (em murganhos adultos injetados intraperitonealmente com lipopolissacarídeo) revelaram que a aplicação exógena da Ago2, sub-expressa pela vasculatura cerebral neste contexto patológico, normalizou marcadores endoteliais associados ao dano induzido pelo processo inflamatório e que, por sua vez, restabeleceu a função glial e neuronal previamente comprometidas. Em seguida, e tendo aferido o potencial da Ago2 para os estudos em contexto de isquémia cerebral, foi definida uma estratégia que promovesse o aumento dos níveis intracelulares desta proteína (também sub-expressa em contexto isquémico) e a sobrevivência endotelial. A entrega controlada de ácido retinóico (uma molécula sinalizadora com propriedades anti-inflamatórias e pró-angiogénicas) através de nanopartículas poliméricas (RA-NP) foi a estratégia definida. Os dados in vitro (em culturas primárias de células endoteliais do cérebro de murganho privadas de oxigénio e glucose) revelaram o potencial protetor das RA-NP em condições isquémicas, apenas observado pela reposição dos níveis basais da proteína Ago2 (um efeito mediado pela via do óxido nítrico), comprovando, uma vez mais, a importância desta proteína na função vascular. Adicionalmente, os dados in vivo (murganhos adultos sujeitos à oclusão transitória da artéria cerebral média) mostraram que a administração sistémica das RA-NP promoveu a sobrevivência do tecido lesado, normalizou a resposta inflamatória e promoveu a reparação neurovascular (com um efeito pró-angiogénico robusto) na região de penumbra durante a isquémia cerebral. No entanto, mais estudos são necessários para estabelecer uma correlação entre o resultado observado in vivo e a proteína Ago2 e para se desvendar as interações desta proteína com o ácido retinóico. Em suma, o trabalho experimental desenvolvido ao longo desta tese forneceu evidências de que a modulação do mecanismo endógeno Ago2 pode ser considerada uma abordagem neuroprotetora, com grande potencial terapêutico na recuperação após o AVC. Para além disso, revelou uma ferramenta nanotecnológica capaz de modular este sistema e, com potencial para ser usada, em conjunto com terapias já existentes, a nível sistémico de forma segura.
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Keywords
Acidente vascular cerebral Isquémia cerebral Vasculatura cerebral Argonauta-2 Ácido retinóico Sistemas de entrega Administração sistémica Neuroinflamação Angiogénese Stroke Brain ischemia Cerebral vasculature