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Abstract(s)
The possibility of selectively alter the expression pattern of a particular gene has been sought by scientists and clinicians for a long time. Nowadays, RNA interference (RNAi)-based technology has become a novel tool for silencing gene expression in cells. In addition, this strategy encloses an enormous therapeutic potential that could change the course of the currently applied treatments in several life threatening pathologies and it is expected that this technology can be translated onto clinical applications in a near future. MicroRNA (miRNA) has become a commonly employed tool for gene silencing, since it prevents protein synthesis by inducing the messenger RNA (mRNA) degradation, with a high specificity degree. Consequently, in the last years, the miRNAs have emerged as biopharmaceuticals to regulate several pathways involved in the insurgence and progression of the Alzheimer’s disease (AD), since they might have key regulatory roles in many neuronal functions, such as differentiation, synaptic plasticity and memory formation, and typically they are down-regulated in disease conditions. In the literature there are some studies describing a causal relationship between miR-29 expression and AD, since a loss of miR-29 cluster can contribute to increased beta-amyloid precursor protein-converting enzyme 1 (BACE1) and Amyloid-β (Aβ) levels in sporadic AD patients. Thus, this evidence supports the possibility to use miR-29 as a potential therapeutic target for AD therapy.
In general, miRNA-based therapy relies on the use of synthetic microRNAs. However, these synthesized formulations typically present contaminants that can lead to non-targeted gene silencing, which still restricts the pre-clinical or clinical application of these RNAs. Thus, considering this therapeutic purpose and the global distribution of novel biopharmaceuticals it is necessary to develop efficient processes for their preparation. The development of new strategies for microRNA production with high purity degree and biologically active is extremely required. One of the strategies might be the use of the recombinant production of biomolecules using prokaryotic hosts.
Hence, the present work intends to develop and establish an integrative biotechnological platform to biosynthesize and purify a recombinant miRNA precursor (pre-miR-29b) to act in the selective silencing of endogenous pathways directly related with AD, in particular BACE1 and Aβ. In addition, the success of these therapies also depends upon the ability to selectively and efficiently deliver the pre-miR-29b in the cytoplasmic compartment of neuronal cells, the location where their function is exerted; therefore the development of miRNA delivery systems was also envisioned.
The expression system Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum) DSM 1374 allowed, for the first time, the production of human pre-miR-29b with a straightforward recuperation of pre-miR-29b in a single step, maintaining its biological active form. The application of this recombinant bacterial microorganism is innovative and is supported by the unusual capacity of secreting the nucleic acids to the extracellular space and the absence of host ribonucleases in the culture medium. Therefore, it is expected that the secreted miRNA will be devoid of main bacterial associated impurities. Regarding the growth conditions, and conversely to what was previously described for this bacterium, our results showed to be possible to develop an original approach for the aerobic growth of the R. sulfidophilum, which results in a cell growth improvement followed by an enhanced production of human pre-miR-29b. The extracellular pre-miR-29b concentration was approximately 182 μg/L, after 40 hours of bacterial growth and the total intracellular pre-miR-29b was of about 358 μg/L, at 32 hours of cell growth.
To further develop a potential therapeutic application, the major interest is not only to produce high quantities of RNA but also to obtain and preserve its biological active form, fulfilling the requirements of regulatory agencies. Hence, to assure that this prerequisite is met it was used a novel and effective purification strategy, based on affinity chromatography, to purify the pre-miR-29b. Therefore, in order to achieve the selectivity towards the target pre-miRNA and the maximum resolution between the pre-miR-29b and other host biomolecules (transfer RNAs and proteins) it was used an affinity support that exploits the same biological interactions that are established within the cell, by using immobilized amino acids (L-lysine and L-arginine), as specific ligands. The recognition of the pre-miR-29b achieved with these supports, allowed its selective recovery from a complex mixture with high efficiency and high purity. In parallel, the binding of pre-miRNA to these different amino acids was studied by Surface Plasmon Resonance. This information brings important insights concerning the characterization of the pre-miRNA binding onto chromatographic supports. Moreover, it was possible to determine some particular conditions enabling the improvement of the binding specificity of the amino acid ligands used to purify miRNA, preserving the RNA integrity. Taking into account that the structure of the chromatographic supports has been continuously developed to afford rapid and efficient separations, namely for the purification of nucleic acids, it was also tested a monolithic support to purify the pre-miR-29b. The association of the high capacity of these supports with the specificity conferred by the agmatine ligand (a derivative of L-arginine) represented a novelty and an advantage to obtain highly pure pre-miR-29b (90%) with a high recovery yield (95%).
The establishment of an effective application of miRNAs is usually constrained by different phenomena, namely their easy degradation when in contact with the body fluids. To overcome this limitation, delivery systems, such as polymeric systems (polyplexes), were developed and characterized in order to encapsulate and protect the pre-miR-29b biopharmaceuticals from degradation, allowing their sustained and targeted release. The formulations prepared with chitosan and polyethylenimine demonstrated high loading capacity, small sizes and exhibited a strong positive charge on their surface. In addition, considering the application field of this work, the delivery systems should also have the ability to penetrate the Blood-Brain Barrier (BBB), causing an increase of the pre-miRNAs concentration in the brain and, consequently the improvement of the therapeutic effect. Actually, BBB is an intrinsic barrier limiting miRNA therapeutic effect on the central nervous system. Thus, to improve the delivery of pre-miRNA therapeutics in the brain, the polyplexes were functionalized with specific ligands, namely lactoferrin and stearic acid which are recognized by cell surface receptors of BBB.
Finally, it was evaluated the biological activity of the recombinant pre-miR-29b by measuring the efficiency on human BACE1 knockdown, using in vitro neuronal cell lines. The effect of recombinant pre-miR-29b administration was verified by both assessing the mRNA and protein human BACE1 levels, by using RT-qPCR, Western blot and Imunocytochemistry. Results suggest that recombinant pre-miR-29b can represent a novel biopharmaceutical product for the therapeutic modulation of human BACE1 levels, because high levels of inhibition were achieved, namely 80% of reduction for BACE1 protein expression and 45% for Aβ42 levels. Globally, the implementation of these cutting-edge technologies can have a great impact on the biopharmaceutical industry, providing the basis for the implementation of novel miRNA-based therapeutics, not only for neurological disorders but also for future therapeutic targets that can be of potential interest.
A recente descoberta da tecnologia do RNA de interferência tornou-se numa nova ferramenta que permite regular seletivamente o padrão de expressão de um ou mais genes, o que pode ser explorado no âmbito de aplicação terapêutica. Deste modo, os resultados promissores desta nova abordagem têm vindo a reforçar a investigação relacionada com o RNA, avaliando e compreendendo os mecanismos celulares em que está envolvido, com o objetivo de o usar como uma nova classe de produtos bioterapêuticos, de fácil translação e implementação para o âmbito clínico. Na verdade, o mecanismo celular responsável pelo silenciamento da expressão génica apresenta um enorme potencial terapêutico que poderá alterar os tratamentos atualmente disponíveis para diversas patologias, como por exemplo as doenças neurológicas. Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe de RNAs de baixo peso molecular e, nos últimos anos, têm sido cada vez mais reconhecidos como moléculas endógenas reguladoras em numerosos processos biológicos. Devido à sua especificidade e eficiência, os miRNAs tornaram-se uma das ferramentas mais utilizadas no silenciamento de genes pelo mecanismo de RNA de interferência, uma vez que podem bloquear a síntese de proteínas através da indução da degradação do RNA mensageiro. Assim, os miRNAs podem ser considerados agentes terapêuticos promissores. Durante a última década, a hipótese de que os miRNAs podem ser usados como biofármacos para regular e controlar várias vias envolvidas no desenvolvimento e progressão da doença de Alzheimer (DA) ganhou consistência, uma vez que estes apresentam um papel crucial em muitas funções neuronais, tais como diferenciação, plasticidade sináptica, formação da memória, e normalmente estão sub-expressos em doentes com esta patologia. A doença de Alzheimer é a forma mais comum de demência e caracteriza-se por uma perda neuronal e sináptica generalizada, que causa um declínio progressivo e irreversível em diversas funções cognitivas. Embora, as causas ainda não sejam completamente compreendidas, sabe-se que esta doença neurodegenerativa está associada ao aparecimento de dois tipos de agregados proteicos, nomeadamente placas extracelulares beta-amiloides (Aβ) e complexos neurofibrilares intraneuronais. A formação das placas de Aβ resulta da clivagem sequencial da proteína percursora amiloide (APP) pela BACE1 e, posteriormente, pelo complexo gama-secretase dando origem às espécies Aβ tóxicas. Alguns estudos têm descrito uma relação causal entre a expressão do miR-29 e a DA, uma vez que a diminuição dos níveis de expressão da família miR-29 tem sido associada ao aumento da expressão da BACE1 e, consequentemente da formação dos péptidos Aβ em doentes com DA. Desta forma, a utilização do miR-29 pode proporcionar uma estratégia terapêutica eficaz na prevenção, controlo da progressão e tratamento desta patologia. As terapêuticas baseadas no uso de miRNAs recorrem, na sua maioria, à utilização de miRNAs sintéticos. Embora a síntese de miRNAs possa ser muito eficiente, verifica-se normalmente a presença de contaminantes nas amostras de RNA sintetizado o pode levar à inespecificidade do silenciamento génico. Além disso, por norma, no processo de preparação do RNA sintético é necessário recorrer à utilização de solventes tóxicos, solventes orgânicos e condições desnaturantes, que podem comprometer a qualidade e integridade do produto alvo. Por todos estes motivos, e considerando o objetivo de aplicação terapêutica destes novos produtos biofarmacêuticos, torna-se evidente a necessidade de desenvolver novos processos eficientes ou melhorar as metodologias atualmente empregues para a sua preparação. Assim, um dos desafios mais importantes no desenvolvimento destas estratégias terapêuticas surge com a necessidade de produzir miRNA com elevado grau de pureza e atividade biológica, de modo a satisfazer os requisitos necessários à sua aplicação. Deste modo, uma das estratégias que pode ser aplicada consiste na produção recombinante de biomoléculas utilizando hospedeiros procarióticos. Desta forma, o objetivo principal do presente trabalho consiste no desenvolvimento e implementação de uma plataforma biotecnológica para a produção e purificação de precursores de miRNAs, em particular o pre-miR-29b (percursor do miR-29), cuja aplicação visa o silenciamento seletivo de vias endógenas diretamente relacionados com DA, nomeadamente a BACE1 e os péptidos Aβ. Paralelamente, serão desenvolvidas e caracterizadas nanopartículas poliméricas para a entrega do pre-miR-29b no citoplasma de células neuronais de forma seletiva e eficaz, de modo a assegurar o sucesso destas administrações. O sistema de expressão recombinante utilizado permitirá, pela primeira vez, a produção e o isolamento do pre-miR-29b humano na bactéria Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum) DSM 1374, mantendo a sua atividade biológica. A utilização deste hospedeiro bacteriano é inovadora e vantajosa, devido à sua capacidade invulgar de secretar os ácidos nucleicos para o meio de cultura, bem como devido à ausência de ribonucleases no mesmo, permitindo a obtenção do miRNA de interesse com baixo conteúdo de impurezas bacterianas. A fim de otimizar a produção e acumulação de miRNAs no espaço extracelular, as condições de crescimento foram estudadas, nomeadamente no que diz respeito ao efeito da temperatura e concentração de cloreto de sódio. Os ensaios realizados demonstraram ser possível desenvolver um protocolo para o crescimento aeróbio da bactéria R. sulfidophilum, na ausência de luz, a 30ºC, o que resulta num melhoramento do crescimento das células, seguido de um aumento da produção do pre-miR-29b humano. Neste trabalho foi possível atingir uma concentração de pre-miR-29b no meio extracelular de aproximadamente 182 μg/L, após 40 horas de crescimento bacteriano e uma concentração de 358 μg/L de pre-miR-29b intracelular, após 32 horas de fermentação. Para que seja possível a aplicação terapêutica do pre-miR-29b é necessário ter em conta as exigências estabelecidas pelas agências reguladoras internacionais, que requerem a produção de miRNA com elevada qualidade e atividade biológica. Para assegurar esta condição, foram desenvolvidas novas estratégias de purificação para o pre-miR-29b, baseadas em cromatografia de afinidade. A fim de alcançar a máxima seletividade e especificidade na separação do pre-miRNA de outras biomoléculas do hospedeiro (outras espécies de RNA e proteínas), foram desenvolvidos suportes de afinidade baseados nas interações biológicas que são estabelecidas a nível celular, usando como ligandos de afinidade, aminoácidos básicos como a L-lisina e a L-arginina. Na estratégia de purificação com o aminoácido de L-lisina foi demonstrada pela primeira vez a purificação de pre-miRNA utilizando um gradiente decrescente de concentração de sulfato de amónio em três passos, o que permitiu explorar maioritariamente interações hidrofóbicas. Contudo, a necessidade de aplicar elevadas concentrações de sal pode ser visto como uma desvantagem devido aos custos e ao impacto ambiental associado ao processo, principalmente no que diz respeito à aplicação ao nível industrial. De modo a ultrapassar estas limitações foi usada L-arginina como aminoácido imobilizado. Este estudo demonstrou a possibilidade de purificar o pre-miR-29b utilizando três estratégias diferentes de eluição, nomeadamente concentrações decrescentes de sulfato de amónio e duas condições de eluição moderadas, tais como usando um gradiente crescente de cloreto de sódio e a adição de um agente de competição (arginina) ao tampão de eluição. A versatilidade da matriz de arginina na purificação do pre-miR-29b sugeriu que o mecanismo de interação envolveria uma multiplicidade de interações não-covalentes, que globalmente resultam no bioreconhecimento do RNA de interesse. O reconhecimento bioespecífico e seletivo do pre-miR-29b por estes suportes cromatográficos permitiu a sua purificação e recuperação de forma eficiente, com elevados rendimentos, grau de pureza e integridade, a partir de uma mistura complexa. Além disso, a utilização da cromatografia de afinidade com arginina resultou na eliminação das impurezas associadas à produção recombinante, nomeadamente proteínas e endotoxinas, respeitando os critérios estabelecidos pelas agências reguladoras (por exemplo “Food and Drug Administration” – FDA). Considerando que esta estratégia cromatográfica requer condições suaves de eluição, torna-se um método de purificação mais económico do que a lisina-agarose. Em paralelo, a ligação do pre-miR-29b aos aminoácidos em estudo foi avaliada por biosensor. Este estudo também permitiu compreender as interações envolvidas entre o pre-miR-29b e as matrizes de lisina- e arginina-agarose, assim como determinar as melhores condições que favorecem o bioreconhecimento e a especificidade de ligação dos aminoácidos ao pre-miR-29b, preservando a sua estabilidade e integridade. Os resultados obtidos neste estudo mostraram a existência de várias interações entre o pre-miR-29b e as matrizes de afinidade com os aminoácidos imobilizados, tais como interações hidrofóbicas, eletrostáticas, catião-π, pontes de hidrogénio e forças de “van der Waals”. Tendo em conta que a estrutura dos suportes cromatográficos está em contínuo desenvolvimento de modo a proporcionar separações rápidas e eficientes, nomeadamente para a purificação de ácidos nucleicos, foi também testado um suporte monolítico na purificação do pre-miR-29b. Esta estratégia que associa a alta capacidade destes suportes com a especificidade e seletividade conferida pelo ligando de agmatina (um derivado da L-arginina), permitiu a recuperação do pre-miR-29b com alta eficiência (95%) e com elevado grau de pureza (90%) para posterior aplicação nos ensaios in vitro. Além disso, este suporte monolítico revelou elevada capacidade de ligação para o RNA, permitindo uma rápida e eficiente separação do pre-miR-29b, independentemente da taxa de fluxo aplicada. No geral, foi possível desenvolver métodos de purificação simples, robustos, versáteis e de elevada reprodutibilidade, que permitiram minimizar o manuseamento das amostras e evitar o uso de condições desnaturantes e solventes orgânicos, contribuindo para o sucesso das aplicações terapêuticas do RNA. No entanto, o sucesso das terapêuticas baseadas em miRNAs depende também da capacidade de entrega do miRNA, de forma seletiva e eficiente, aos órgãos-alvo, com a mínima toxicidade. De facto, a entrega cerebral de fármacos é limitada por diversos fatores intrínsecos, nomeadamente a sua rápida degradação quando em contato com os fluidos corporais e a reduzida permeabilidade ao longo da barreira hematoencefálica (BHE). Para ultrapassar estas limitações, vários sistemas de entrega de fármacos não-virais têm sido desenvolvidos e caracterizados, nomeadamente os sistemas poliméricos (poliplexos) que possuem características intrínsecas ideais para a transfecção, proteção e libertação controlada e direcionada de RNA. No presente trabalho, as formulações foram preparadas com polímeros comerciais, tais como quitosano e polietilenimina e demonstraram elevada capacidade de transporte de RNA, apresentando pequenas dimensões e uma forte carga superficial positiva. Além disso, e considerando o campo de aplicação do presente trabalho, estes sistemas devem também ter a capacidade de penetrar a BHE, levando a um aumento da concentração do pre-miRNA no cérebro e, consequentemente uma melhoria da sua ação terapêutica. Deste modo, a fim de potenciar o efeito terapêutico das abordagens baseadas no RNAi no sistema nervoso central, os poliplexos desenvolvidos foram funcionalizados com ligandos específicos, tais como a lactoferrina e o ácido esteárico, os quais são reconhecidos pelos recetores localizados à superfície da BHE. Este estudo revelou que os sistemas de entrega desenvolvidos conseguem penetrar a BHE e assim entregar o pre-miR-29b no cérebro. Finalmente, avaliou-se a atividade biológica do pre-miR-29b recombinante através da verificação da sua eficiência na regulação dos níveis de expressão dos genes relacionados com a DA, em particular no silenciamento da BACE1 humana, utilizando modelos in vitro (linhas de células neuronais). O efeito da administração do pre-miR-29b recombinante foi verificado tanto ao nível da expressão do RNA mensageiro como ao nível da expressão da proteína BACE1, através de RT-qPCR, Western blot e Imunocitoquímica. Os resultados sugerem que o pre-miR-29b recombinante pode funcionar como biofármaco para a modulação terapêutica dos níveis de BACE1, uma vez que foram atingidos elevados níveis de inibição, ou seja 80% de redução para a expressão da proteína BACE1 e 45% para os níveis dos péptidos beta amiloides, quando comparados com as células não transfectadas e células transfectadas como um RNA não relacionado bem como um miR-29b sintético. Em suma, a implementação destas metodologias terá um grande impacto na indústria farmacêutica e biotecnológica, fornecendo a base para a utilização de novas formas terapêuticas baseadas na utilização de miRNAs, não apenas para aplicação em doenças neurológicas, mas também para futuros alvos terapêuticos que possam ser de interesse.
A recente descoberta da tecnologia do RNA de interferência tornou-se numa nova ferramenta que permite regular seletivamente o padrão de expressão de um ou mais genes, o que pode ser explorado no âmbito de aplicação terapêutica. Deste modo, os resultados promissores desta nova abordagem têm vindo a reforçar a investigação relacionada com o RNA, avaliando e compreendendo os mecanismos celulares em que está envolvido, com o objetivo de o usar como uma nova classe de produtos bioterapêuticos, de fácil translação e implementação para o âmbito clínico. Na verdade, o mecanismo celular responsável pelo silenciamento da expressão génica apresenta um enorme potencial terapêutico que poderá alterar os tratamentos atualmente disponíveis para diversas patologias, como por exemplo as doenças neurológicas. Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe de RNAs de baixo peso molecular e, nos últimos anos, têm sido cada vez mais reconhecidos como moléculas endógenas reguladoras em numerosos processos biológicos. Devido à sua especificidade e eficiência, os miRNAs tornaram-se uma das ferramentas mais utilizadas no silenciamento de genes pelo mecanismo de RNA de interferência, uma vez que podem bloquear a síntese de proteínas através da indução da degradação do RNA mensageiro. Assim, os miRNAs podem ser considerados agentes terapêuticos promissores. Durante a última década, a hipótese de que os miRNAs podem ser usados como biofármacos para regular e controlar várias vias envolvidas no desenvolvimento e progressão da doença de Alzheimer (DA) ganhou consistência, uma vez que estes apresentam um papel crucial em muitas funções neuronais, tais como diferenciação, plasticidade sináptica, formação da memória, e normalmente estão sub-expressos em doentes com esta patologia. A doença de Alzheimer é a forma mais comum de demência e caracteriza-se por uma perda neuronal e sináptica generalizada, que causa um declínio progressivo e irreversível em diversas funções cognitivas. Embora, as causas ainda não sejam completamente compreendidas, sabe-se que esta doença neurodegenerativa está associada ao aparecimento de dois tipos de agregados proteicos, nomeadamente placas extracelulares beta-amiloides (Aβ) e complexos neurofibrilares intraneuronais. A formação das placas de Aβ resulta da clivagem sequencial da proteína percursora amiloide (APP) pela BACE1 e, posteriormente, pelo complexo gama-secretase dando origem às espécies Aβ tóxicas. Alguns estudos têm descrito uma relação causal entre a expressão do miR-29 e a DA, uma vez que a diminuição dos níveis de expressão da família miR-29 tem sido associada ao aumento da expressão da BACE1 e, consequentemente da formação dos péptidos Aβ em doentes com DA. Desta forma, a utilização do miR-29 pode proporcionar uma estratégia terapêutica eficaz na prevenção, controlo da progressão e tratamento desta patologia. As terapêuticas baseadas no uso de miRNAs recorrem, na sua maioria, à utilização de miRNAs sintéticos. Embora a síntese de miRNAs possa ser muito eficiente, verifica-se normalmente a presença de contaminantes nas amostras de RNA sintetizado o pode levar à inespecificidade do silenciamento génico. Além disso, por norma, no processo de preparação do RNA sintético é necessário recorrer à utilização de solventes tóxicos, solventes orgânicos e condições desnaturantes, que podem comprometer a qualidade e integridade do produto alvo. Por todos estes motivos, e considerando o objetivo de aplicação terapêutica destes novos produtos biofarmacêuticos, torna-se evidente a necessidade de desenvolver novos processos eficientes ou melhorar as metodologias atualmente empregues para a sua preparação. Assim, um dos desafios mais importantes no desenvolvimento destas estratégias terapêuticas surge com a necessidade de produzir miRNA com elevado grau de pureza e atividade biológica, de modo a satisfazer os requisitos necessários à sua aplicação. Deste modo, uma das estratégias que pode ser aplicada consiste na produção recombinante de biomoléculas utilizando hospedeiros procarióticos. Desta forma, o objetivo principal do presente trabalho consiste no desenvolvimento e implementação de uma plataforma biotecnológica para a produção e purificação de precursores de miRNAs, em particular o pre-miR-29b (percursor do miR-29), cuja aplicação visa o silenciamento seletivo de vias endógenas diretamente relacionados com DA, nomeadamente a BACE1 e os péptidos Aβ. Paralelamente, serão desenvolvidas e caracterizadas nanopartículas poliméricas para a entrega do pre-miR-29b no citoplasma de células neuronais de forma seletiva e eficaz, de modo a assegurar o sucesso destas administrações. O sistema de expressão recombinante utilizado permitirá, pela primeira vez, a produção e o isolamento do pre-miR-29b humano na bactéria Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum) DSM 1374, mantendo a sua atividade biológica. A utilização deste hospedeiro bacteriano é inovadora e vantajosa, devido à sua capacidade invulgar de secretar os ácidos nucleicos para o meio de cultura, bem como devido à ausência de ribonucleases no mesmo, permitindo a obtenção do miRNA de interesse com baixo conteúdo de impurezas bacterianas. A fim de otimizar a produção e acumulação de miRNAs no espaço extracelular, as condições de crescimento foram estudadas, nomeadamente no que diz respeito ao efeito da temperatura e concentração de cloreto de sódio. Os ensaios realizados demonstraram ser possível desenvolver um protocolo para o crescimento aeróbio da bactéria R. sulfidophilum, na ausência de luz, a 30ºC, o que resulta num melhoramento do crescimento das células, seguido de um aumento da produção do pre-miR-29b humano. Neste trabalho foi possível atingir uma concentração de pre-miR-29b no meio extracelular de aproximadamente 182 μg/L, após 40 horas de crescimento bacteriano e uma concentração de 358 μg/L de pre-miR-29b intracelular, após 32 horas de fermentação. Para que seja possível a aplicação terapêutica do pre-miR-29b é necessário ter em conta as exigências estabelecidas pelas agências reguladoras internacionais, que requerem a produção de miRNA com elevada qualidade e atividade biológica. Para assegurar esta condição, foram desenvolvidas novas estratégias de purificação para o pre-miR-29b, baseadas em cromatografia de afinidade. A fim de alcançar a máxima seletividade e especificidade na separação do pre-miRNA de outras biomoléculas do hospedeiro (outras espécies de RNA e proteínas), foram desenvolvidos suportes de afinidade baseados nas interações biológicas que são estabelecidas a nível celular, usando como ligandos de afinidade, aminoácidos básicos como a L-lisina e a L-arginina. Na estratégia de purificação com o aminoácido de L-lisina foi demonstrada pela primeira vez a purificação de pre-miRNA utilizando um gradiente decrescente de concentração de sulfato de amónio em três passos, o que permitiu explorar maioritariamente interações hidrofóbicas. Contudo, a necessidade de aplicar elevadas concentrações de sal pode ser visto como uma desvantagem devido aos custos e ao impacto ambiental associado ao processo, principalmente no que diz respeito à aplicação ao nível industrial. De modo a ultrapassar estas limitações foi usada L-arginina como aminoácido imobilizado. Este estudo demonstrou a possibilidade de purificar o pre-miR-29b utilizando três estratégias diferentes de eluição, nomeadamente concentrações decrescentes de sulfato de amónio e duas condições de eluição moderadas, tais como usando um gradiente crescente de cloreto de sódio e a adição de um agente de competição (arginina) ao tampão de eluição. A versatilidade da matriz de arginina na purificação do pre-miR-29b sugeriu que o mecanismo de interação envolveria uma multiplicidade de interações não-covalentes, que globalmente resultam no bioreconhecimento do RNA de interesse. O reconhecimento bioespecífico e seletivo do pre-miR-29b por estes suportes cromatográficos permitiu a sua purificação e recuperação de forma eficiente, com elevados rendimentos, grau de pureza e integridade, a partir de uma mistura complexa. Além disso, a utilização da cromatografia de afinidade com arginina resultou na eliminação das impurezas associadas à produção recombinante, nomeadamente proteínas e endotoxinas, respeitando os critérios estabelecidos pelas agências reguladoras (por exemplo “Food and Drug Administration” – FDA). Considerando que esta estratégia cromatográfica requer condições suaves de eluição, torna-se um método de purificação mais económico do que a lisina-agarose. Em paralelo, a ligação do pre-miR-29b aos aminoácidos em estudo foi avaliada por biosensor. Este estudo também permitiu compreender as interações envolvidas entre o pre-miR-29b e as matrizes de lisina- e arginina-agarose, assim como determinar as melhores condições que favorecem o bioreconhecimento e a especificidade de ligação dos aminoácidos ao pre-miR-29b, preservando a sua estabilidade e integridade. Os resultados obtidos neste estudo mostraram a existência de várias interações entre o pre-miR-29b e as matrizes de afinidade com os aminoácidos imobilizados, tais como interações hidrofóbicas, eletrostáticas, catião-π, pontes de hidrogénio e forças de “van der Waals”. Tendo em conta que a estrutura dos suportes cromatográficos está em contínuo desenvolvimento de modo a proporcionar separações rápidas e eficientes, nomeadamente para a purificação de ácidos nucleicos, foi também testado um suporte monolítico na purificação do pre-miR-29b. Esta estratégia que associa a alta capacidade destes suportes com a especificidade e seletividade conferida pelo ligando de agmatina (um derivado da L-arginina), permitiu a recuperação do pre-miR-29b com alta eficiência (95%) e com elevado grau de pureza (90%) para posterior aplicação nos ensaios in vitro. Além disso, este suporte monolítico revelou elevada capacidade de ligação para o RNA, permitindo uma rápida e eficiente separação do pre-miR-29b, independentemente da taxa de fluxo aplicada. No geral, foi possível desenvolver métodos de purificação simples, robustos, versáteis e de elevada reprodutibilidade, que permitiram minimizar o manuseamento das amostras e evitar o uso de condições desnaturantes e solventes orgânicos, contribuindo para o sucesso das aplicações terapêuticas do RNA. No entanto, o sucesso das terapêuticas baseadas em miRNAs depende também da capacidade de entrega do miRNA, de forma seletiva e eficiente, aos órgãos-alvo, com a mínima toxicidade. De facto, a entrega cerebral de fármacos é limitada por diversos fatores intrínsecos, nomeadamente a sua rápida degradação quando em contato com os fluidos corporais e a reduzida permeabilidade ao longo da barreira hematoencefálica (BHE). Para ultrapassar estas limitações, vários sistemas de entrega de fármacos não-virais têm sido desenvolvidos e caracterizados, nomeadamente os sistemas poliméricos (poliplexos) que possuem características intrínsecas ideais para a transfecção, proteção e libertação controlada e direcionada de RNA. No presente trabalho, as formulações foram preparadas com polímeros comerciais, tais como quitosano e polietilenimina e demonstraram elevada capacidade de transporte de RNA, apresentando pequenas dimensões e uma forte carga superficial positiva. Além disso, e considerando o campo de aplicação do presente trabalho, estes sistemas devem também ter a capacidade de penetrar a BHE, levando a um aumento da concentração do pre-miRNA no cérebro e, consequentemente uma melhoria da sua ação terapêutica. Deste modo, a fim de potenciar o efeito terapêutico das abordagens baseadas no RNAi no sistema nervoso central, os poliplexos desenvolvidos foram funcionalizados com ligandos específicos, tais como a lactoferrina e o ácido esteárico, os quais são reconhecidos pelos recetores localizados à superfície da BHE. Este estudo revelou que os sistemas de entrega desenvolvidos conseguem penetrar a BHE e assim entregar o pre-miR-29b no cérebro. Finalmente, avaliou-se a atividade biológica do pre-miR-29b recombinante através da verificação da sua eficiência na regulação dos níveis de expressão dos genes relacionados com a DA, em particular no silenciamento da BACE1 humana, utilizando modelos in vitro (linhas de células neuronais). O efeito da administração do pre-miR-29b recombinante foi verificado tanto ao nível da expressão do RNA mensageiro como ao nível da expressão da proteína BACE1, através de RT-qPCR, Western blot e Imunocitoquímica. Os resultados sugerem que o pre-miR-29b recombinante pode funcionar como biofármaco para a modulação terapêutica dos níveis de BACE1, uma vez que foram atingidos elevados níveis de inibição, ou seja 80% de redução para a expressão da proteína BACE1 e 45% para os níveis dos péptidos beta amiloides, quando comparados com as células não transfectadas e células transfectadas como um RNA não relacionado bem como um miR-29b sintético. Em suma, a implementação destas metodologias terá um grande impacto na indústria farmacêutica e biotecnológica, fornecendo a base para a utilização de novas formas terapêuticas baseadas na utilização de miRNAs, não apenas para aplicação em doenças neurológicas, mas também para futuros alvos terapêuticos que possam ser de interesse.
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Keywords
Doença de Alzheimer Cromatografia de Afinidade Direcionamento ao cérebro Silenciamento Génico Pre-miR-29b humano Produção Recombinante Eficiência de Transfecção Poliplexos