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Authors
Abstract(s)
The choroid plexus is a multifunctional tissue responsible for a wide range of homeostatic
functions crucial to the central nervous system, including secretion of cerebrospinal fluid,
synthesis and secretion of important peptides and regulation of the chemical substances
exchange between the blood and the cerebrospinal fluid, through the blood-cerebrospinal fluid
barrier. Transthyretin, a protein highly expressed and secreted by choroid plexus to the
cerebrospinal fluid, is the major amyloid-beta scavenger protein, contributing to its clearance.
Sex hormones, as estrogens, upregulate transthyretin expression in choroid plexus, and as a
consequence its regulation may be disrupted by substances that interfere with various cellular
pathways regulated by endogenous hormones, known as endocrine disruptors chemicals. The
human population is exposed to many chemicals with such properties, such as bisphenol A.
Therefore, the present study analysed the effects of the endocrine disruptor bisphenol A on
transthyretin expression in newborn rats by Whole-Mount fluorescent staining and Western blot,
and at the mRNA level by Real time RT-PCR. Moreover, the effects of beta-amyloid on
transthyretin expression were also investigated using the same techniques in choroid explants
of newborn and young rats. Blood-cerebrospinal fluid barrier plays an important role in the
regulation of molecules movement between choroid plexus and cerebrospinal fluid, and it
disruption can happen when choroid plexus functions are impaired. Thus, one purpose of this
work was determine the effects of both compounds, beta-amyloid and bisphenol A, in bloodcerebrospinal
fluid barrier integrity through the evaluation of some membrane protein levels
present in this barrier, namely, occludin, E-cadherin, claudin-1 and zonula occludens-1.
Beta-amyloid treatment in rat choroid plexus seems to trigger transthyretin upregulation, in a
dose-response manner. Transthyretin mRNA levels in newborn rat choroid plexus explants
increased much more than in young explants. Increased transthyretin expression levels were
not correlated with secretion levels. Additionally, beta-amyloid at 1ug/mL increased reactive
oxygen species production in choroid plexus. Low doses of bisphenol A affected transthyretin
expression in rat choroid plexus in a non-monotonic dose response way, accordingly to data
previously reported in other studies with bisphenol A. The same response profile was observed
in transthyretin protein and mRNA levels measured, with higher transthyretin levels verified at
50nM of bisphenol A. As reported before with beta-amyloid treatment, also bisphenol A lead to
an increase of transthyretin expression in choroid plexus cells, which was not altered with
significance the secretion levels of this protein.
Beta-amyloid and bisphenol A clearly influence transthyretin expression in rat choroid plexus,
in a dose-response manner, and in a non-monotonic dose response, respectively. In accordance
to previous reports, increasing beta-amyloid levels induced transthyretin upregulation. Increased transthyretin production by choroid plexus seems to be a protective mechanisms to
avoid beta-amyloid fibrillization and consequent toxicity. Bisphenol A interfered with
transthyretin expression, in both positive and negative ways. Therefore, bisphenol A levels
might lead to up or down of transthyretin regulation, and consequently, leading to impairment
of beta-amyloid levels in brain. Blood-cerebrospinal fluid barrier integrity might be
compromised by beta-amyloid and bisphenol A injuries, which explains alteration in secretion
rates of controls for treated choroid plexus explants. However, further investigation is required
to analyse evolution of transthyretin expression by choroid plexus throughout life, and would
be also important evaluate bisphenol A effects in blood-cerebrospinal fluid barrier protein
levels, to better understand bisphenol A consequences in beta-amyloid clearance.
No sistema ventricular cerebral encontram-se 4 plexos coróides, um em cada ventrículo, os quais desempenham importantes funções, diretamente envolvidas na homeostasia do sistema nervoso central. Destas funções destacam-se a secreção do líquido cefalorraquidiano, a síntese e secreção de inúmeras substâncias bioactivas (proteínas, citocinas, vitaminas), bem como a regulação da passagem de moléculas entre a corrente sanguínea e o líquido cefalorraquidiano, através da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano. Esta barreira formada pelas células epiteliais do plexo coróide é composta por inúmeras proteínas membranares denominadas tight junctions e adherens junctions, que são fundamentais para manter a sua integridade, e assegurar a função secretora do plexo coróide. O plexo coróide é ainda responsável pela síntese e secreção da transtirretina, a principal proteína envolvida no catabolismo do péptido beta amilóide, cuja deposição no cérebro é uma das principais marcas etimológicas da doença de Alzheimer. Quando secretada para o líquido cefalorraquidiano, a transtirretina forma complexos estáveis com o beta-amilóide, evitando a sua agregação e fibrilação, e consequentemente, os efeitos tóxicos inerentes à acumulação destes agregados. A expressão da transtirretina é regulada positivamente pelas hormonas sexuais, nas quais se incluem os estrogénios. Estas hormonas podem ver as suas ações mimetizadas por certos compostos denominados por disruptores endócrinos, cuja crescente difusão no meio ambiente e entre as populações tem levantado várias questões sobre a sua implicação na saúde pública. Um dos disruptores endócrinos mais estudado é o bisfenol A, um xenoestrogénio, altamente difundido no meio ambiente, e ao qual a exposição humana foi comprovada em inúmeros estudos. Posto isto, este trabalho tem como principal objetivo avaliar o efeito do bisfenol A na expressão da transtirretina, em explantes de plexo coroide de rato, e a sua consequente relação no catabolismo do beta-amilóide. Além disto, também se averiguou se a expressão da transtirretina no plexo coróide sofre modificações, em ratos de diferentes idades, e se essa expressão tem alguma relação com o aumento dos níveis de beta-amilóide. Adicionalmente, a expressão de algumas proteínas descritas na barreira sangue-fluido cefalorraquidiano (occludina, e-caderina, claudina-1 e zonula occludens-1) foi avaliada nos explantes de plexos coróides após o tratamento com o beta-amilóide e o bisfenol A, de modo a perceber se estes compostos interferem na integridade desta barreira. A expressão da transtirretina foi analisada ex vivo, em explantes de plexos coróides de ratos recém-nascidos e de ratos jovens tratados com beta-amilóide e, em explantes de recém nascidos tratados com bisfenol A. Para tal, recorreu-se a várias técnicas: Whole mount (imunohistoquímica por fluorescência), Real-time PCR e Western Blot. A localização e expressão das proteínas membranares foi estudada através de Whole mount e Western blot. Nos explantes de plexo coróide tratados com beta-amilóide houve um aumento na expressão da transtirretina, correlacionado com o aumento da concentração de beta-amilóide, que se verificou em ambas as idades estudadas, de forma semelhante. A maior diferença ocorreu relativamente à expressão de mRNA da transtirretina nos explantes dos animais recémnascidos, onde os níveis de transtirretina são bastante elevados, mais do que nos explantes dos jovens. Por outro lado e, contrariando o esperado, não houve um aumento na excreção desta proteína, mas sim um ligeiro decréscimo. Foi ainda avaliada a produção de espécies reativas de oxigénio nos explantes de plexo coróide de ratos jovens onde houve um aumento significativo relativamente aos controlos. Nos plexos coróides tratados com bisfenol A, verificaram-se modificações na expressão da transtirretina mesmo com baixas doses do composto, as quais estão de acordo com os níveis referidos em estudos epidemiológicos. Além disto, os níveis de expressão da transtirretina nestes explantes mostraram seguir uma curva com resposta nãomonotónica, tal como observado em vários outros estudos, e característico da exposição aos disruptores endócrinos. A expressão da transtirretina nos plexos coroides foi maior para a concentração de 50nM de BPA comparativamente às outras concentrações testadas, tanto para os níveis da proteína como para os de mRNA. Contudo, a secreção da transtirretina não acompanhou o aumento da sua expressão. Tanto o beta-amilóide como o bisfenol A mostraram-se capazes de interferir na expressão da transtirretina no plexo coróide de rato, de forma dose-dependente e não-monotónica, respetivamente. O aumento da produção de transtirretina pelo plexo coróide quando os níveis de beta amilóide estão aumentados parece tratar-se de um mecanismo de proteção para evitar a agregação do péptido e consequente toxicidade. Relativamente ao bisfenol A, este consegue modular a expressão da transtirretina tanto positivamente como negativamente, o que poderá ter consequências nos níveis de transtirretina produzidos e libertados para o líquido cefalorraquidiano, e assim, interferir nos níveis de beta amilóide no cérebro. Tendo em conta as discrepâncias observadas entre os níveis de expressão da transtirretina e da sua secreção, para ambos os compostos estudados, a integridade da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano poderá estar comprometida, e dessa forma, contribuir para o desequilíbrio do beta-amilóide. Assim, tanto o beta-amilóide como o bisfenol A interferem na produção de transtirretina no plexo coróide de rato. Contudo, é necessário investigar a relação entre a transtirretina e o beta-amilóide ao longo do envelhecimento, para perceber se é a diminuição da transtirretina a responsável pela acumulação do beta-amilóide, nomeadamente na doença de Alzheimer, ou se é o péptido que contribuiu para a disfunção do plexo coróide levando à diminuição da transtirretina. Será ainda importante investigar os níveis das proteínas da barreira sanguelíquido cefalorraquidiano, para melhor entender de que forma o bisfenol A pode levar a um aumento de beta amilóide, ao interferir não só na expressão da transtirretina como também nas funções do plexo coróide.
No sistema ventricular cerebral encontram-se 4 plexos coróides, um em cada ventrículo, os quais desempenham importantes funções, diretamente envolvidas na homeostasia do sistema nervoso central. Destas funções destacam-se a secreção do líquido cefalorraquidiano, a síntese e secreção de inúmeras substâncias bioactivas (proteínas, citocinas, vitaminas), bem como a regulação da passagem de moléculas entre a corrente sanguínea e o líquido cefalorraquidiano, através da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano. Esta barreira formada pelas células epiteliais do plexo coróide é composta por inúmeras proteínas membranares denominadas tight junctions e adherens junctions, que são fundamentais para manter a sua integridade, e assegurar a função secretora do plexo coróide. O plexo coróide é ainda responsável pela síntese e secreção da transtirretina, a principal proteína envolvida no catabolismo do péptido beta amilóide, cuja deposição no cérebro é uma das principais marcas etimológicas da doença de Alzheimer. Quando secretada para o líquido cefalorraquidiano, a transtirretina forma complexos estáveis com o beta-amilóide, evitando a sua agregação e fibrilação, e consequentemente, os efeitos tóxicos inerentes à acumulação destes agregados. A expressão da transtirretina é regulada positivamente pelas hormonas sexuais, nas quais se incluem os estrogénios. Estas hormonas podem ver as suas ações mimetizadas por certos compostos denominados por disruptores endócrinos, cuja crescente difusão no meio ambiente e entre as populações tem levantado várias questões sobre a sua implicação na saúde pública. Um dos disruptores endócrinos mais estudado é o bisfenol A, um xenoestrogénio, altamente difundido no meio ambiente, e ao qual a exposição humana foi comprovada em inúmeros estudos. Posto isto, este trabalho tem como principal objetivo avaliar o efeito do bisfenol A na expressão da transtirretina, em explantes de plexo coroide de rato, e a sua consequente relação no catabolismo do beta-amilóide. Além disto, também se averiguou se a expressão da transtirretina no plexo coróide sofre modificações, em ratos de diferentes idades, e se essa expressão tem alguma relação com o aumento dos níveis de beta-amilóide. Adicionalmente, a expressão de algumas proteínas descritas na barreira sangue-fluido cefalorraquidiano (occludina, e-caderina, claudina-1 e zonula occludens-1) foi avaliada nos explantes de plexos coróides após o tratamento com o beta-amilóide e o bisfenol A, de modo a perceber se estes compostos interferem na integridade desta barreira. A expressão da transtirretina foi analisada ex vivo, em explantes de plexos coróides de ratos recém-nascidos e de ratos jovens tratados com beta-amilóide e, em explantes de recém nascidos tratados com bisfenol A. Para tal, recorreu-se a várias técnicas: Whole mount (imunohistoquímica por fluorescência), Real-time PCR e Western Blot. A localização e expressão das proteínas membranares foi estudada através de Whole mount e Western blot. Nos explantes de plexo coróide tratados com beta-amilóide houve um aumento na expressão da transtirretina, correlacionado com o aumento da concentração de beta-amilóide, que se verificou em ambas as idades estudadas, de forma semelhante. A maior diferença ocorreu relativamente à expressão de mRNA da transtirretina nos explantes dos animais recémnascidos, onde os níveis de transtirretina são bastante elevados, mais do que nos explantes dos jovens. Por outro lado e, contrariando o esperado, não houve um aumento na excreção desta proteína, mas sim um ligeiro decréscimo. Foi ainda avaliada a produção de espécies reativas de oxigénio nos explantes de plexo coróide de ratos jovens onde houve um aumento significativo relativamente aos controlos. Nos plexos coróides tratados com bisfenol A, verificaram-se modificações na expressão da transtirretina mesmo com baixas doses do composto, as quais estão de acordo com os níveis referidos em estudos epidemiológicos. Além disto, os níveis de expressão da transtirretina nestes explantes mostraram seguir uma curva com resposta nãomonotónica, tal como observado em vários outros estudos, e característico da exposição aos disruptores endócrinos. A expressão da transtirretina nos plexos coroides foi maior para a concentração de 50nM de BPA comparativamente às outras concentrações testadas, tanto para os níveis da proteína como para os de mRNA. Contudo, a secreção da transtirretina não acompanhou o aumento da sua expressão. Tanto o beta-amilóide como o bisfenol A mostraram-se capazes de interferir na expressão da transtirretina no plexo coróide de rato, de forma dose-dependente e não-monotónica, respetivamente. O aumento da produção de transtirretina pelo plexo coróide quando os níveis de beta amilóide estão aumentados parece tratar-se de um mecanismo de proteção para evitar a agregação do péptido e consequente toxicidade. Relativamente ao bisfenol A, este consegue modular a expressão da transtirretina tanto positivamente como negativamente, o que poderá ter consequências nos níveis de transtirretina produzidos e libertados para o líquido cefalorraquidiano, e assim, interferir nos níveis de beta amilóide no cérebro. Tendo em conta as discrepâncias observadas entre os níveis de expressão da transtirretina e da sua secreção, para ambos os compostos estudados, a integridade da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano poderá estar comprometida, e dessa forma, contribuir para o desequilíbrio do beta-amilóide. Assim, tanto o beta-amilóide como o bisfenol A interferem na produção de transtirretina no plexo coróide de rato. Contudo, é necessário investigar a relação entre a transtirretina e o beta-amilóide ao longo do envelhecimento, para perceber se é a diminuição da transtirretina a responsável pela acumulação do beta-amilóide, nomeadamente na doença de Alzheimer, ou se é o péptido que contribuiu para a disfunção do plexo coróide levando à diminuição da transtirretina. Será ainda importante investigar os níveis das proteínas da barreira sanguelíquido cefalorraquidiano, para melhor entender de que forma o bisfenol A pode levar a um aumento de beta amilóide, ao interferir não só na expressão da transtirretina como também nas funções do plexo coróide.
Description
Keywords
Amyloid-Beta Bisphenol A Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier Choroid Plexus Tight Junctions Transthyretin