Loading...
Publication
From production to purification: Towards an integrative process for recombinant pre-miRNA-29b as biopharmaceutical
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| Documento em Acesso Embargado até dia 14-03-2028. Tente solicitar cópia ao autor carregando no ficheiro. | 7.99 MB | Adobe PDF |
Authors
Abstract(s)
Recent advances in RNA research have greatly demonstrated the potential of RNA-based therapies, offering innovative ways to target a variety of diseases with enhanced specificity. Unlike traditional small-molecule drugs, RNA therapeutics like small-interfering RNA and microRNA (miRNA) can precisely regulate gene expression and target specific biological pathways. For instance, recent studies demonstrate that miRNA-29 regulates some pathological routes associated with Alzheimer's disease (AD), a neurodegenerative disorder affecting millions of people around the world. MiRNA-29 plays a crucial role in processes like amyloid-β peptides (Aβ) formation, which contributes to memory loss and neuronal cell damage. Low levels of miRNA-29 are linked to increased production and activity of the enzyme β-secretase (BACE1), which leads to higher production of Aβ and, consequently, β-plaque formation. Given its important functions, restoring or increasing miRNA-29 levels in AD patients can be a promising strategy for AD treatment. Current research is investigating the use of recombinant miRNA-29b precursor (pre-miRNA-29b) to silence BACE1 expression and decrease Aβ levels, aiming to develop novel approaches to slow the progression of AD.
Given this, biopharmaceuticals production and subsequent purification constitute an important process that needs to be in full accordance with criteria established by regulatory entities. Regarding RNA production, the standard technique is through chemical synthesis, however this strategy comes with some disadvantages, namely the biomolecules length that can be correctly produced and the low production levels. Recombinant production is the alternative method that is more cost-effective and applicable for large-scale production. Escherichia coli is the most widely used and studied host, nonetheless, Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum) presents interesting characteristics considering nucleic acids production, that comprise the ability to secrete nucleic acids to the extracellular medium, without secreting RNases. The recovery of recombinantly produced nucleic acids from the extracellular medium might be a great advantage for the further downstream processing because the contaminants, such as cell debris and endotoxins, are not present, as usually are in the intracellular samples.
The downstream process is the most expensive stage of the whole bioprocess, and usually, several chromatographic steps are required to achieve the intended purity and quality. Given this, there is a high demand for specific and efficient purification strategies. Multimodal chromatography is currently under thorough research as it can lead to the same specificity for target compounds as it is observed for affinity chromatography, without using biological ligands that greatly increase the process cost. Ionic Liquids (ILs) are molten salts that can present this multimodal character when used as ligands immobilized onto the stationary phase, being recently studied for nucleic acids purification. The different moieties of the cation in an IL can allow the exploitation of different types of interactions with the target molecule. Therefore, this Doctoral Thesis explores a promising and alternative recombinant host for the production of pre-miRNA-29b, as well as its purification using newly synthesized resins, aiming for the development of a whole bioprocess.
Initially, a DNA vector was designed to produce the target pre-miRNA-29b in R. sulfidophilum. In this study, the impact of the plasmid on bacterial growth was analysed and compared to the non-transformed strain. The transformed strain has shown a global growth about 5 times lower than the non-transformed strain, but this did not impact negatively the target RNA production. An optimization of the extracellular extraction protocol was also conducted during this study, comparing a protocol with ethanol or isopropanol as precipitation agents. The results proven that the protocol using isopropanol as precipitation agent was more efficient reaching a concentration of 0.7 μg of pre-miRNA-29b per liter of medium.
After successfully developing an efficient pre-miRNA-29b production system, it became important to develop a purification strategy. For this, four different silica-based Ionic Liquids (SILs) were synthesized and evaluated on their ability for nucleic acids separation. An initial screening of binding and elution conditions with a low molecular weight RNA sample was performed by using both ionic and hydrophobic conditions, to select the more promising support for further purification assays. The support SSi[C3C3NH2Im]Cl was selected, proving to be highly efficient in separating different species of DNA (genomic and plasmidic) from RNA. Then, it became important to test this support regarding its ability for pre-miRNA-29b purification from other types of RNAs. Given that this approach is more challenging due to the high physical and chemical similarity among small RNAs, four different ILs were employed in this stage to act as competition agents aiming to enhance target selectivity. From the four tested ILs, the 1-ethylimidazolium chloride was proven to have a higher impact on the pre-miRNA-29b selectivity improvement, achieving 76% purity.
Since the aim is to develop a method suitable for a biopharmaceutical production and purification, it would be needed to achieve higher purity levels than what was verified with SSi[C3C3NH2Im]Cl. Therefore, a commercial multimodal resin, Capto Q ImpRes was chosen to analyse and compare its performance to the previous newly synthesized support. Both intra- and extracellular RNA samples were tested regarding pre-miRNA-29b purification, and a Design of Experiments (DoE) was established for each sample. Screening assays with intracellular RNA sample were made to identify the factors to be implemented in the DoE. Sodium chloride concentration and pH were defined, and it was possible to establish conditions that uncover a balance between the recovery and purity of the target. For intracellular RNA samples, the DoE effectively identified optimal purification parameters, attaining recovery rates up to 73% and purity levels around 78%. However, these two responses shown to be almost inversely proportional. Nonetheless, it was possible to achieve the optimal point with a recovery of 48.21% and purity of 51.15%. On the other hand, purifying extracellular pre-miRNA-29b presented substantial challenges, exhibiting significant inconsistencies in purity and difficulties in identifying the target molecule, probably due to the low concentration of pre-miRNA in the extracellular extract and the difficulty in detection.
To search for an alternative that could lead to an improved selectivity for the biopharmaceutical under study, a set of several oligonucleotides were designed to interact with the target. Initially, 13 oligonucleotides were designed to interact through base complementarity with different regions of the target. Each oligonucleotide was linked to a carbon chain (6 or 12 carbons) with an amino group, resulting in 26 different ligands. After data analysis, some ligands showed higher specificity for their target sites, while others demonstrated versatility in recognizing multiple sites. Based on this, 4 oligonucleotides were identified as the most promising for further experimental testing.
Overall, in this doctoral thesis, a bioprocess was developed starting with the upstream stage with recombinant production of the pre-miRNA-29b, followed by the downstream stage exploiting different approaches applicable to target purification. The work opens the route for the development of an integrated production and purification process for pre-miRNA-29b, with great potential for large-scale translation.
Os recentes avanços da investigação na área do RNA têm vindo a reforçar o potencial das terapias baseadas nesta biomolécula, providenciando formas inovadoras e mais eficientes para o tratamento de doenças sem uma terapia eficaz reconhecida. Contrariamente aos medicamentos convencionais, as terapias baseadas em RNA, como o RNA de interferência (siRNA) e o micro RNA (miRNA), podem regular com precisão a expressão génica e influenciar vias biológicas que, com as abordagens tradicionais, seriam difíceis de alcançar. O recente sucesso das vacinas de mRNA para o controlo da pandemia associada à COVID-19 alavancou ainda mais o interesse neste tipo de terapias, conduzindo ao desenvolvimento de novos ensaios clínicos com resultados promissores para determinadas doenças, como vários tipos de cancro ou doenças infeciosas. No caso dos mecanismos de silenciamento, desencadeados por siRNAs, miRNAs, ou oligonucleótidos antissense, o foco de aplicação tem estado associado a patologias onde se verifica acumulação ou produção desregulada de proteínas específicas. Estudos recentes descrevem o miRNA-29 como um agente regulatório importante no desenvolvimento e progressão da doença de Alzheimer (DA), uma doença neurológica que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. O miRNA-29 desempenha um papel crucial nas vias patológicas associadas à DA, como a acumulação de péptidos β-amilóide, alterações na proteína tau e inflamação, que consequentemente resultam em alterações nas células neuronais que causam problemas cognitivos e de memória. Níveis reduzidos de miRNA-29 estão relacionados ao aumento da expressão e atividade da enzima β-secretase (BACE1), o que leva a uma produção aumentada de péptidos β-amilóide e à posterior formação de placas. Dadas estas evidências, restaurar ou aumentar os níveis de miRNA-29 pode ser considerada como uma estratégia promissora para o tratamento dos problemas cognitivos associados à DA. Atualmente, está a ser investigada a aplicação da forma precursora do miRNA-29b (pre-miRNA-29b) recombinante para a redução de expressão da proteína BACE1 e, consequentemente, dos níveis de placa β-amilóide, com o objetivo de desenvolver novas intervenções terapêuticas para o retrocesso e/ou abrandamento da progressão da DA. Posto isto, a produção de biofármacos, nomeadamente de pre-miRNA-29b, e posterior purificação constitui um processo importante que necessita de estar em total conformidade com a regulamentação estabelecida pelas entidades regulamentares. No que diz respeito à produção de RNA, a técnica padrão é a síntese química, contudo, esta estratégia apresenta algumas desvantagens, nomeadamente o limitado tamanho do RNA que pode ser corretamente produzido e os baixos níveis de produção. A produção recombinante é o método alternativo mais rentável e mais aplicável para a produção em grande escala, como é realizado, por exemplo, para a produção de insulina. Para esta abordagem, a bactéria Escherichia coli é o hospedeiro mais estudado e utilizado, no entanto recentemente começou a ser explorada a utilização do hospedeiro Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum) que apresenta características bastante interessantes. Considerando a produção de ácidos nucleicos, a bactéria R. sulfidophilum apresenta a capacidade de secretar ácidos nucleicos para o meio extracelular, sem secretar RNases. Assim, a recuperação de ácidos nucleicos produzidos de forma recombinante a partir do meio extracelular pode ser uma grande vantagem para o posterior processo de purificação, pois os contaminantes, como restos celulares e endotoxinas não estão presentes, como normalmente acontece com as amostras de extração a partir do ambiente intracelular. O processo de downstream constitui a parte mais dispendiosa de todo o bioprocesso, sendo essencial a combinação de vários tipos de cromatografia, dependendo da natureza física e química do biofármaco alvo. A utilização de várias etapas de cromatografia é crucial para garantir o elevado nível de pureza e qualidade necessárias a um produto e aplicação terapêutica. Perante isto, a procura por estratégias de purificação altamente específicas e eficientes é de elevada relevância. A cromatografia multimodal está atualmente sob investigação exaustiva, uma vez que pode ser alcançada a mesma especificidade para os compostos alvo que observada com a cromatografia de afinidade, sem a necessidade de utilizar ligandos biológicos que aumentam grandemente o custo do processo. Os Líquidos Iónicos (ILs) que são sais líquidos à temperatura ambiente, que podem apresentar este carácter multimodal quando utilizados como ligandos da fase estacionária, têm sido recentemente estudados para a purificação de ácidos nucleicos. Os diferentes grupos funcionais do catião num IL, como as cadeias carbonadas, os grupos amina e/ou fenil permitem explorar diferentes tipos de interações com a molécula alvo, dependendo também das condições experimentais estabelecidas. Assim sendo, este projeto procura explorar um hospedeiro recombinante promissor e alternativo para a produção recombinante do pre-miRNA-29b, bem como o estudo posterior de estratégias de purificação deste RNA, utilizando suportes cromatográficos sintetizados de novo, visando o desenvolvimento de todo um bioprocesso desde a fase upstream até à fase downstream. Inicialmente, foi desenhado um vetor para expressar o pre-miRNA-29b alvo em R. sulfidophilum. Neste estudo, o impacto do plasmídeo no crescimento bacteriano foi analisado e comparado com a estirpe não transformada. A estirpe transformada mostrou crescer cerca de 5 vezes menos do que a estirpe não transformada, contudo, isto não teve impacto negativo na produção da molécula alvo. Foi também realizada a otimização do protocolo de recuperação do pre-miRNA alvo a partir do ambiente extracelular, comparando um protocolo que recorre ao etanol ou isopropanol como agentes de precipitação. Os resultados comprovaram que o protocolo que recorre ao isopropanol como agente de precipitação mostrou ser mais eficiente, pois para além de exigir menos tempo, o consumo de reagentes é também menor, sendo ainda eficaz na recuperação da molécula alvo, atingindo uma concentração de 0,7 μg de pre-miRNA-29b por litro de meio de cultura. Após o desenvolvimento do sistema de expressão do pre-miRNA-29b, tornou-se importante desenvolver também uma estratégia de purificação. Para tal, foram sintetizados quatro líquidos iónicos diferentes baseados em sílica (SILs) que foram avaliados quanto à sua capacidade de separação de ácidos nucleicos. Os líquidos iónicos em estudo foram: 1-metilimidazol (SSi[C3C1Im]Cl), N,N-dimetilbutilamina (SSi[N3114]Cl), N,N-dimetiletilenodiamina (SSi[N3112NH2]Cl) e 1-(3-aminopropil)imidazol (SSi [C3C3NH2Im]Cl). Foi realizado um screening inicial das condições de ligação e eluição com uma amostra de RNAs de baixo peso molecular, tanto em condições iónicas como hidrofóbicas, de forma a selecionar o suporte mais promissor para ensaios de purificação posteriores. Após este screening, o suporte SSi[C3C3NH2Im]Cl foi selecionado, comprovando ser altamente eficiente na separação de diferentes espécies de DNA (genómico e plasmídico) do RNA. A estabilidade do RNA foi também avaliada e confirmada após o processo de purificação, validando assim a aplicabilidade do método. Após os estudos iniciais, tornou-se importante testar este suporte quanto à sua capacidade para uma purificação mais específica, nomeadamente purificando seletivamente o alvo pre-miRNA-29b de outros tipos de RNAs presentes na amostra. Sendo que esta abordagem seria mais desafiante devido à elevada semelhança física e química entre os pequenos RNA, foram aplicados quatro ILs diferentes na etapa de recuperação para atuarem como agentes de competição com o objetivo de aumentar a seletividade para o alvo. Dos quatro ILs testados como aditivos, o cloreto de etilimidazol demonstrou ter um maior impacto na melhoria de seletividade para o pre-miRNA-29b, sendo possível atingir cerca de 76% de pureza. Uma vez que o objetivo é desenvolver um método adequado para a produção e purificação de um biofármaco, seria necessário atingir uma pureza superior à verificada com SSi[C3C3NH2Im]Cl. Neste sentido, foi escolhida uma matriz comercial multimodal, Capto Q ImpRes, para analisar e comparar o seu desempenho com o suporte sintetizado anteriormente. Neste trabalho, as amostras de RNA intra- e extracelular foram testadas para a purificação do pre-miRNA-29b, tendo sido aplicado um Desenho Experimental (DoE) para cada uma das amostras. Como abordagem inicial, foram feitos ensaios de screening com a amostra de RNA intracelular para identificar os fatores que seriam aplicados no DoE. Através desta otimização foram definidos fatores críticos como a concentração de sal e o pH, tendo sido possível encontrar condições que estabelecessem um equilíbrio entre a recuperação e a pureza da molécula alvo. Para as amostras de RNA intracelular, o DoE identificou eficazmente os parâmetros de purificação ideais, atingindo taxas de recuperação até 73% e níveis de pureza de cerca de 78%. No entanto, estas duas respostas mostraram ser quase inversamente proporcionais, o que significa que para obter um nível de pureza elevado, a recuperação seria consideravelmente comprometida. Ainda assim, foi possível comprovar o ponto ótimo, com uma recuperação de 48.21% e pureza de 51.15%. Quanto à purificação do pre-miRNA-29b extracelular, foram encontrados desafios substanciais, sendo verificadas inconsistências significativas nos resultados de pureza e dificuldades na identificação da molécula alvo, provavelmente devido à sua baixa concentração e suscetibilidade à degradação durante as etapas de extração e manuseamento. Como alternativa de purificação e com o objetivo de melhorar a seletividade para o biofármaco em estudo, foi desenhado um conjunto de oligonucleótidos para interagir com o pre-miRNA alvo por complementaridade de bases. Os ligandos foram desenhados e selecionados através de ferramentas computacionais, tornando o trabalho mais simples, económico e amigo do ambiente. Inicialmente, foram desenhados 13 oligonucleótidos para interagir com o pre-miRNA-29b através da complementaridade de bases com diferentes regiões (região hairpin e extremidades 3’ e 5’) do pre-miRNA-29b. Cada oligonucleótido apresenta uma cadeia carbonada (6 ou 12 carbonos) com um grupo amina, mimetizando a estrutura de um ligando para possível imobilização num suporte cromatográfico, resultando assim em 26 ligandos diferentes. Após análise dos dados obtidos, alguns ligandos apresentaram maior especificidade para os seus locais-alvo para os quais tinham sido desenhados, enquanto outros, demonstraram versatilidade no reconhecimento de múltiplos locais. Com base nestas evidências, 4 oligonucleótidos foram identificados como os mais promissores para testes experimentais, uma vez que se observou que formavam complexos estáveis com o alvo, principalmente através de ligações de hidrogénio. Globalmente, nesta tese de doutoramento foi possível estudar as diferentes etapas associadas ao desenvolvimento de um bioprocesso completo, começando pela etapa upstream, com produção recombinante do biofármaco pre-miRNA-29b, passando também pela etapa downstream, explorando diferentes abordagens aplicáveis à recuperação e purificação da biomolécula de interesse. Assim, este trabalho constitui um ponto de partida para o desenvolvimento de um processo integrado de produção e purificação de pre-miRNA-29b, com grande potencial para transposição em larga escala.
Os recentes avanços da investigação na área do RNA têm vindo a reforçar o potencial das terapias baseadas nesta biomolécula, providenciando formas inovadoras e mais eficientes para o tratamento de doenças sem uma terapia eficaz reconhecida. Contrariamente aos medicamentos convencionais, as terapias baseadas em RNA, como o RNA de interferência (siRNA) e o micro RNA (miRNA), podem regular com precisão a expressão génica e influenciar vias biológicas que, com as abordagens tradicionais, seriam difíceis de alcançar. O recente sucesso das vacinas de mRNA para o controlo da pandemia associada à COVID-19 alavancou ainda mais o interesse neste tipo de terapias, conduzindo ao desenvolvimento de novos ensaios clínicos com resultados promissores para determinadas doenças, como vários tipos de cancro ou doenças infeciosas. No caso dos mecanismos de silenciamento, desencadeados por siRNAs, miRNAs, ou oligonucleótidos antissense, o foco de aplicação tem estado associado a patologias onde se verifica acumulação ou produção desregulada de proteínas específicas. Estudos recentes descrevem o miRNA-29 como um agente regulatório importante no desenvolvimento e progressão da doença de Alzheimer (DA), uma doença neurológica que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. O miRNA-29 desempenha um papel crucial nas vias patológicas associadas à DA, como a acumulação de péptidos β-amilóide, alterações na proteína tau e inflamação, que consequentemente resultam em alterações nas células neuronais que causam problemas cognitivos e de memória. Níveis reduzidos de miRNA-29 estão relacionados ao aumento da expressão e atividade da enzima β-secretase (BACE1), o que leva a uma produção aumentada de péptidos β-amilóide e à posterior formação de placas. Dadas estas evidências, restaurar ou aumentar os níveis de miRNA-29 pode ser considerada como uma estratégia promissora para o tratamento dos problemas cognitivos associados à DA. Atualmente, está a ser investigada a aplicação da forma precursora do miRNA-29b (pre-miRNA-29b) recombinante para a redução de expressão da proteína BACE1 e, consequentemente, dos níveis de placa β-amilóide, com o objetivo de desenvolver novas intervenções terapêuticas para o retrocesso e/ou abrandamento da progressão da DA. Posto isto, a produção de biofármacos, nomeadamente de pre-miRNA-29b, e posterior purificação constitui um processo importante que necessita de estar em total conformidade com a regulamentação estabelecida pelas entidades regulamentares. No que diz respeito à produção de RNA, a técnica padrão é a síntese química, contudo, esta estratégia apresenta algumas desvantagens, nomeadamente o limitado tamanho do RNA que pode ser corretamente produzido e os baixos níveis de produção. A produção recombinante é o método alternativo mais rentável e mais aplicável para a produção em grande escala, como é realizado, por exemplo, para a produção de insulina. Para esta abordagem, a bactéria Escherichia coli é o hospedeiro mais estudado e utilizado, no entanto recentemente começou a ser explorada a utilização do hospedeiro Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum) que apresenta características bastante interessantes. Considerando a produção de ácidos nucleicos, a bactéria R. sulfidophilum apresenta a capacidade de secretar ácidos nucleicos para o meio extracelular, sem secretar RNases. Assim, a recuperação de ácidos nucleicos produzidos de forma recombinante a partir do meio extracelular pode ser uma grande vantagem para o posterior processo de purificação, pois os contaminantes, como restos celulares e endotoxinas não estão presentes, como normalmente acontece com as amostras de extração a partir do ambiente intracelular. O processo de downstream constitui a parte mais dispendiosa de todo o bioprocesso, sendo essencial a combinação de vários tipos de cromatografia, dependendo da natureza física e química do biofármaco alvo. A utilização de várias etapas de cromatografia é crucial para garantir o elevado nível de pureza e qualidade necessárias a um produto e aplicação terapêutica. Perante isto, a procura por estratégias de purificação altamente específicas e eficientes é de elevada relevância. A cromatografia multimodal está atualmente sob investigação exaustiva, uma vez que pode ser alcançada a mesma especificidade para os compostos alvo que observada com a cromatografia de afinidade, sem a necessidade de utilizar ligandos biológicos que aumentam grandemente o custo do processo. Os Líquidos Iónicos (ILs) que são sais líquidos à temperatura ambiente, que podem apresentar este carácter multimodal quando utilizados como ligandos da fase estacionária, têm sido recentemente estudados para a purificação de ácidos nucleicos. Os diferentes grupos funcionais do catião num IL, como as cadeias carbonadas, os grupos amina e/ou fenil permitem explorar diferentes tipos de interações com a molécula alvo, dependendo também das condições experimentais estabelecidas. Assim sendo, este projeto procura explorar um hospedeiro recombinante promissor e alternativo para a produção recombinante do pre-miRNA-29b, bem como o estudo posterior de estratégias de purificação deste RNA, utilizando suportes cromatográficos sintetizados de novo, visando o desenvolvimento de todo um bioprocesso desde a fase upstream até à fase downstream. Inicialmente, foi desenhado um vetor para expressar o pre-miRNA-29b alvo em R. sulfidophilum. Neste estudo, o impacto do plasmídeo no crescimento bacteriano foi analisado e comparado com a estirpe não transformada. A estirpe transformada mostrou crescer cerca de 5 vezes menos do que a estirpe não transformada, contudo, isto não teve impacto negativo na produção da molécula alvo. Foi também realizada a otimização do protocolo de recuperação do pre-miRNA alvo a partir do ambiente extracelular, comparando um protocolo que recorre ao etanol ou isopropanol como agentes de precipitação. Os resultados comprovaram que o protocolo que recorre ao isopropanol como agente de precipitação mostrou ser mais eficiente, pois para além de exigir menos tempo, o consumo de reagentes é também menor, sendo ainda eficaz na recuperação da molécula alvo, atingindo uma concentração de 0,7 μg de pre-miRNA-29b por litro de meio de cultura. Após o desenvolvimento do sistema de expressão do pre-miRNA-29b, tornou-se importante desenvolver também uma estratégia de purificação. Para tal, foram sintetizados quatro líquidos iónicos diferentes baseados em sílica (SILs) que foram avaliados quanto à sua capacidade de separação de ácidos nucleicos. Os líquidos iónicos em estudo foram: 1-metilimidazol (SSi[C3C1Im]Cl), N,N-dimetilbutilamina (SSi[N3114]Cl), N,N-dimetiletilenodiamina (SSi[N3112NH2]Cl) e 1-(3-aminopropil)imidazol (SSi [C3C3NH2Im]Cl). Foi realizado um screening inicial das condições de ligação e eluição com uma amostra de RNAs de baixo peso molecular, tanto em condições iónicas como hidrofóbicas, de forma a selecionar o suporte mais promissor para ensaios de purificação posteriores. Após este screening, o suporte SSi[C3C3NH2Im]Cl foi selecionado, comprovando ser altamente eficiente na separação de diferentes espécies de DNA (genómico e plasmídico) do RNA. A estabilidade do RNA foi também avaliada e confirmada após o processo de purificação, validando assim a aplicabilidade do método. Após os estudos iniciais, tornou-se importante testar este suporte quanto à sua capacidade para uma purificação mais específica, nomeadamente purificando seletivamente o alvo pre-miRNA-29b de outros tipos de RNAs presentes na amostra. Sendo que esta abordagem seria mais desafiante devido à elevada semelhança física e química entre os pequenos RNA, foram aplicados quatro ILs diferentes na etapa de recuperação para atuarem como agentes de competição com o objetivo de aumentar a seletividade para o alvo. Dos quatro ILs testados como aditivos, o cloreto de etilimidazol demonstrou ter um maior impacto na melhoria de seletividade para o pre-miRNA-29b, sendo possível atingir cerca de 76% de pureza. Uma vez que o objetivo é desenvolver um método adequado para a produção e purificação de um biofármaco, seria necessário atingir uma pureza superior à verificada com SSi[C3C3NH2Im]Cl. Neste sentido, foi escolhida uma matriz comercial multimodal, Capto Q ImpRes, para analisar e comparar o seu desempenho com o suporte sintetizado anteriormente. Neste trabalho, as amostras de RNA intra- e extracelular foram testadas para a purificação do pre-miRNA-29b, tendo sido aplicado um Desenho Experimental (DoE) para cada uma das amostras. Como abordagem inicial, foram feitos ensaios de screening com a amostra de RNA intracelular para identificar os fatores que seriam aplicados no DoE. Através desta otimização foram definidos fatores críticos como a concentração de sal e o pH, tendo sido possível encontrar condições que estabelecessem um equilíbrio entre a recuperação e a pureza da molécula alvo. Para as amostras de RNA intracelular, o DoE identificou eficazmente os parâmetros de purificação ideais, atingindo taxas de recuperação até 73% e níveis de pureza de cerca de 78%. No entanto, estas duas respostas mostraram ser quase inversamente proporcionais, o que significa que para obter um nível de pureza elevado, a recuperação seria consideravelmente comprometida. Ainda assim, foi possível comprovar o ponto ótimo, com uma recuperação de 48.21% e pureza de 51.15%. Quanto à purificação do pre-miRNA-29b extracelular, foram encontrados desafios substanciais, sendo verificadas inconsistências significativas nos resultados de pureza e dificuldades na identificação da molécula alvo, provavelmente devido à sua baixa concentração e suscetibilidade à degradação durante as etapas de extração e manuseamento. Como alternativa de purificação e com o objetivo de melhorar a seletividade para o biofármaco em estudo, foi desenhado um conjunto de oligonucleótidos para interagir com o pre-miRNA alvo por complementaridade de bases. Os ligandos foram desenhados e selecionados através de ferramentas computacionais, tornando o trabalho mais simples, económico e amigo do ambiente. Inicialmente, foram desenhados 13 oligonucleótidos para interagir com o pre-miRNA-29b através da complementaridade de bases com diferentes regiões (região hairpin e extremidades 3’ e 5’) do pre-miRNA-29b. Cada oligonucleótido apresenta uma cadeia carbonada (6 ou 12 carbonos) com um grupo amina, mimetizando a estrutura de um ligando para possível imobilização num suporte cromatográfico, resultando assim em 26 ligandos diferentes. Após análise dos dados obtidos, alguns ligandos apresentaram maior especificidade para os seus locais-alvo para os quais tinham sido desenhados, enquanto outros, demonstraram versatilidade no reconhecimento de múltiplos locais. Com base nestas evidências, 4 oligonucleótidos foram identificados como os mais promissores para testes experimentais, uma vez que se observou que formavam complexos estáveis com o alvo, principalmente através de ligações de hidrogénio. Globalmente, nesta tese de doutoramento foi possível estudar as diferentes etapas associadas ao desenvolvimento de um bioprocesso completo, começando pela etapa upstream, com produção recombinante do biofármaco pre-miRNA-29b, passando também pela etapa downstream, explorando diferentes abordagens aplicáveis à recuperação e purificação da biomolécula de interesse. Assim, este trabalho constitui um ponto de partida para o desenvolvimento de um processo integrado de produção e purificação de pre-miRNA-29b, com grande potencial para transposição em larga escala.
Description
Keywords
RNA pre-miRNA-29b Produção recombinante Rhodovulum sulfidophilum Cromatografia Líquidos Iónicos Cromatografia multimodal Desenho Experimental