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Authors
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Abstract(s)
Photodynamic therapy (PDT) comprises the administration of a photosensitizer (PS) and its accumulation within the tumor site, followed by irradiation with light of a specific wavelength. Consequently, singlet oxygen and other reactive oxygen/nitrogen species (ROS/RNS) are produced from bioavailable oxygen at the tumor’s microenvironment and are responsible for the tumor’s eradication. PDT works effectively in certain types of cancer, but poorly in tumors that reside in internal organs and organ structures such as the pancreas and biliary tree. Moreover, adverse effect such as skin phototoxicity is a major obstacle to more widespread clinical applicability. To that end, we encapsulated a second-generation of PS into liposomal carriers that are targeted to the tumor interstitium after intravenous administration. Therefore, this doctoral thesis describes essentially the evaluation and comparison between lipophilic metallated-phthalocyanines (ZnPC and AlPC) encapsulated in interstitially-targeted liposomes (ITLs), and their corresponding hydrophilic derivatives (ZnPCS4 and AlPCS4). To do so, we initiated the doctoral research through our first study by performing an attritional assessment in vitro using A431 cells as a template for tumor cells with a dysfunctional P53 tumor suppressor gene and epidermal growth factor receptor (EGFR) overexpression. As a methodology for our investigations, we have first assessed the dark toxicity as a function of PS concentration using the water-soluble tetrazolium salt (WST-1) and sulforhodamine B dyes as an indication of the cell viability. Using the same principle, we then drew the LC50 values for each PS through PDT at 671 nm and a light exposure of 15 J/cm2 following 1 hour of PS exposure. We continued our research looking into a time-dependent uptake and intracellular distribution of the PS, and we finalized our first study with the assessment of the mode of cell death as well as the cell cycle arrest at 24 hours after PDT. Through this research we observed that, in the absence of illumination, AlPC and ZnPC in ITLs were not toxic to cells up to a 1.5 μM PS concentration and exposure for up to 72 h, but for AlPCS4 and ZnPCS4, the dark toxicity was at 5 μM and at 2.5 μM, respectively. However, PDT of cells photosensitized with ZnPC, AlPC, and AlPCS4 yielded LC50 values of 0.13 μM, 0.04 μM, and 0.81 μM, respectively (24 hours post-PDT based on sulforhodamine B assay). The uptake of all PSs was observed as early as 1 min after PS addition to cells and increased in amplitude during a 2-h incubation period. ZnPCS4 did not induce notable phototoxicity, which was echoed in the mode of cell death and cell cycle arrest data. However, AlPCS4 induced considerable necrosis in addition to apoptosis, whereby most of the cell death had already manifested as early as 2 h after PDT. Cell death signaling coincided with a reduction in cells in the G0/G1 phase (ZnPC, AlPC, AlPCS4) and cell cycle arrest in the S-phase (ZnPC, AlPC, AlPCS4) and G2 phase (ZnPC and AlPC). With the intention of validating our previous research, we have moved forward with the investigations through a second study by using our comparative model with the four metallated-phthalocyanines in a human cholangiocarcinoma cell line and tumor-comprising cells (endothelial cells, fibroblasts, and macrophages), as a representation of the tumor’s microenvironment. In addition to all parameters assessed in the previous study, we went one step further and evaluated the systemic toxicity of each PS in zebrafish and in chicken embryos, and while using BALB/c nude mice as our in vivo model, we researched for signs of skin phototoxicity. A pilot study on PDT efficacy was also performed in BALB/c nude mice bearing human triple-negative breast cancer (MDA-MB-231) xenografts. The key findings were that photodynamically active PSs (all except ZnPCS4) were able to effectively photosensitize cancer cells and non-cancerous cells. In addition, PSs in study did not induced any notable systemic toxicity in zebrafish and chicken embryos. However, ITL-delivered ZnPC and ZnPCS4 were associated with skin phototoxicity, while the aluminum containing PSs did not exert any detectable sign of cutaneous phototoxicity. Last but not least, ITL-delivered ZnPC and AlPC are equally effective in their tumor-killing capacity in human tumor breast cancer xenografts, and superior to other non-phthalocyanine PSs when appraised on a per mole administered dose basis. In summary, the research on the applications of ZnPCS4 for oncological PDT will be discontinued in our group as it failed the attrition step regarding phototoxicity and it showed alarming signs of cutaneous phototoxicity. It is therefore concluded that AlPC and its derivative AlPCS4 are the least toxic and most effective PSs to employ with respect to ITLs as part of the comprehensive tumor targeting and PS delivery platform.
A terapia fotodinâmica (do inglês PDT) baseia-se essencialmente na administração de um fotossensibilizador e da sua acumulação no local do tumor, seguido de irradiação com luz de comprimento de onda específico. Consequentemente, o oxigénio singleto e outras espécies reativas de oxigénio/nitrogénio (ROS/RNS) são produzidos a partir de oxigénio biodisponível no microambiente do tumor, e são os principais responsáveis pela erradicação do tumor por meio de três mecanismos distintos: 1) morte celular por apoptose/necrose/autofagia; 2) rutura microvascular do tumor mediado por trombose; e 3) uma resposta anti-tumoral do sistema imunitário. PDT funciona de forma eficaz em certos tipos de cancro, mas menos eficaz em tumores que se alojam em órgãos internos e estruturas de órgãos, como por exemplo: o pâncreas e a árvore biliar. Além disso, efeitos adversos como a fototoxicidade da pele, são um grande obstáculo para uma ampla aplicabilidade no setor clínico. Os pacientes precisam de residir em ambientes escuros durante semanas após a terapia, para se protegerem da luz solar, o que é anti-ético nos casos em que os pacientes têm apenas alguns meses de vida. Nesse sentido, o objetivo da presente tese consiste na investigação de fotonanomedicamentos mais adequados para estes pacientes. Para esse fim, foram encapsulados fotossensibilizadores de segunda geração em transportadores lipossomais que são direcionados ao interstício do tumor após administração intravenosa. Os ftalocianine metalados, como o ftalocianine de zinco lipofílico (ZnPC) e o ftalocianine de alumínio (AlPC), bem como seus derivados tetrassulfonados hidrofílicos (ZnPCS4 e AlPCS4), atestam todos os requisitos clínicos para uso em PDT. No entanto, até o momento não houve comparação direta para determinar qual desses fotossensibilizadores é o mais fototóxico para as células tumorais e, portanto, merece mais desenvolvimento pré-clínico e clínico. Esses estudos serão conduzidos de forma a que permita a seleção do fotossensibilizador ideal para o desenvolvimento de uma terceira e quarta geração de fotossensibilizadores (por exemplo, co-encapsulamento de inibidores de vias de sobrevivência de células tumorais com fotossensibilizadores de segunda geração). A presente tese descreve a avaliação e a comparação entre os ftalocianines metalados (ZnPC e AlPC) encapsulados em lipossomas com alvo para o interstício tumoral (ITLs), e os seus equivalentes hidrofílicos (ZnPCS4 e AlPCS4). Para isso, iniciamos a investigação através de uma avaliação in vitro usando células A431 como modelo para células tumorais, com uma disfunção no gene supressor tumoral P53 e superexpressão do receptor de factor de crescimento epidermal (EGFR). Como metodologia numa primeira abordagem foi avaliada a toxicidade no escuro (sem luz de ativação para a PDT) em função da concentração de fotossensibilizadores, utilizando os corantes WST-1 e sulforrodamina B como indicação da viabilidade celular. Seguiu-se o registo da captura celular em detrimento do tempo de exposição com os fotossensibilizadores, e também da sua distribuição a nível intracelular. Ambos os parâmetros foram determinados através da técnica de citometria de fluxo e de microscopia confocal, usando a fluorescência intrínseca dos fotossensibilizadores. Os valores de LC50 foram então estabelecidos para cada PS a um cumprimento de onda de 671 nm e uma exposição radiante de 15 J/cm2, após 1 hora de exposição com os fotossensibilizadores. Finalizamos o nosso primeiro estudo com a avaliação da morte celular em função do tempo pós-PDT, e também com a análise do ciclo celular 24 horas após a PDT. Através desta investigação observamos que, na ausência de iluminação, AlPC e ZnPC em ITLs não foram tóxicos para as células até uma concentração de 1,5 μM (exposição por até 72 h). No entanto, AlPCS4 e ZnPCS4 demonstraram toxicidade no escuro na ordem dos 5 μM e dos 2,5 μM, respetivamente. A absorção de todos os fotossensibilizadores foi observada tão cedo quanto 1 min após a adição de fotossensibilizadores às células, e aumentou em amplitude durante um período de incubação de 2 h. Porém, após 60 min de incubação com os fotossensibilizadores, todo o espaço não nuclear da célula foi fotossensibilizado, com a acumulação dos fotossensibilizadores em múltiplas estruturas subcelulares, especialmente no caso de AlPC e AlPCS4. A PDT de células fotossensibilizadas com ZnPC, AlPC e AlPCS4 foi capaz de produzir valores de LC50 na ordem dos 0,13 μM, 0,04 μM e 0,81 μM, respetivamente (24 horas após PDT, com base no ensaios com sulforrodamina B). O ZnPCS4 não foi capaz de induzir fototoxicidade, o que foi igualmente observado nos resultados obtidos na análise da morte celular e também do ciclo celular. Nas 4 h após PDT, a morte celular resumiu-se principalmente à apoptose para ZnPC e AlPC, que foi gradualmente aumentada em células fotossensibilizadas com AlPC durante 8 h. Por sua vez, as células tratadas com ZnPC recuperaram nas 8 h após PDT em comparação com 4 h pós-PDT. O AlPCS4 foi capaz de induzir a morte celular de forma significativa por necrose para além da apoptose, sendo que a maior parte da morte celular já se havia manifestado 2 h após a PDT. Durante o período de 8 h, a morte celular por via necrótica que era inicialmente a mais predominante, mas foi perdendo para a morte celular apoptótica tardia. A sinalização de morte celular coincidiu com redução de células na fase G0/G1 (ZnPC, AlPC, AlPCS4) e com a redução da atividade celular na fase S (ZnPC, AlPC, AlPCS4) e fase G2 (ZnPC e AlPC) do ciclo celular. A interrupção do ciclo celular foi mais profunda em células que foram incubadas com AlPC e submetidas a PDT. Com a intenção de validar resultados prévios, foram delineadas experiências utilizando o nosso modelo comparativo com os quatro ftalocianines metalados numa linhagem representativa da população celular num tumor (células endoteliais, fibroblastos e macrófagos), e também utilizando células de colangiocarcinoma humano como representante de células cancerígenas. Para além de todos os parâmetros avaliados no estudo anterior, optou-se por dar um passo em frente na investigação, e foi avaliada também a toxicidade sistémica de cada fotossensibilizador em embriões de peixe-zebra (Danio rerio) e galinha (Gallus gallus domesticus). Além disso, determinou-se o risco de fototoxicidade da pele usando murganhos (Mus musculus) BALB/c nude como modelo in vivo. Um estudo piloto sobre a eficácia da PDT também foi realizado em murganhos nude BALB/c portadores de xenoenxertos humanos de cancro de mama triplo negativo (MDA-MB-231). Como principais resultados observou-se que todos os fotossensibilizadores ativos (exceto ZnPCS4) foram capazes de fotossensibilizar efetivamente células cancerígenas e células não cancerosas. Além disso, os fotossensibilizadores em estudo não induziram nenhuma toxicidade sistémica significativa em embriões de peixe-zebra e galinha. No entanto, ZnPCS4 e ZnPC em ITLs foram associados à fototoxicidade da pele, enquanto os fotossensibilizadores contendo alumínio não exerceram nenhuma fototoxicidade detetável no tecido cutâneo. Por último, ZnPC e AlPC encapsulados em ITLs são igualmente eficazes em reduzir o volume tumoral de xenoenxertos de cancro da mama humano em murganhos nude BALB/c, e foram superiores a outros fotossensibilizadores fora do grupo dos ftalocianines quando avaliados em detrimento da dose administrada por mol. Em resumo, as investigações envolvendo o ZnPCS4 para terapia fotodinâmica oncológica serão descontinuadas no nosso grupo, já que ZnPCS4 demonstrou-se menos eficaz comparativamente aos restantes fotossensibilizadores em estudo. Por outro lado, ZnPCS4 revelou também sinais alarmantes de fototoxicidade cutânea. Deste modo, através das investigações incluídas na presente tese de doutoramento concluímos que AlPC e o seu derivativo hidrofílico AlPCS4 são os fotossensibilizadores menos tóxicos e mais eficazes. Assim sendo, pretendem-se continuar com estes dois fotossensibilizadores em futuros estudos rumo ao desenvolvimento de uma plataforma integrando os ITLs juntamente com outro agente quimioterápico para o tratamento eficaz de tumores sólidos através da PDT.
A terapia fotodinâmica (do inglês PDT) baseia-se essencialmente na administração de um fotossensibilizador e da sua acumulação no local do tumor, seguido de irradiação com luz de comprimento de onda específico. Consequentemente, o oxigénio singleto e outras espécies reativas de oxigénio/nitrogénio (ROS/RNS) são produzidos a partir de oxigénio biodisponível no microambiente do tumor, e são os principais responsáveis pela erradicação do tumor por meio de três mecanismos distintos: 1) morte celular por apoptose/necrose/autofagia; 2) rutura microvascular do tumor mediado por trombose; e 3) uma resposta anti-tumoral do sistema imunitário. PDT funciona de forma eficaz em certos tipos de cancro, mas menos eficaz em tumores que se alojam em órgãos internos e estruturas de órgãos, como por exemplo: o pâncreas e a árvore biliar. Além disso, efeitos adversos como a fototoxicidade da pele, são um grande obstáculo para uma ampla aplicabilidade no setor clínico. Os pacientes precisam de residir em ambientes escuros durante semanas após a terapia, para se protegerem da luz solar, o que é anti-ético nos casos em que os pacientes têm apenas alguns meses de vida. Nesse sentido, o objetivo da presente tese consiste na investigação de fotonanomedicamentos mais adequados para estes pacientes. Para esse fim, foram encapsulados fotossensibilizadores de segunda geração em transportadores lipossomais que são direcionados ao interstício do tumor após administração intravenosa. Os ftalocianine metalados, como o ftalocianine de zinco lipofílico (ZnPC) e o ftalocianine de alumínio (AlPC), bem como seus derivados tetrassulfonados hidrofílicos (ZnPCS4 e AlPCS4), atestam todos os requisitos clínicos para uso em PDT. No entanto, até o momento não houve comparação direta para determinar qual desses fotossensibilizadores é o mais fototóxico para as células tumorais e, portanto, merece mais desenvolvimento pré-clínico e clínico. Esses estudos serão conduzidos de forma a que permita a seleção do fotossensibilizador ideal para o desenvolvimento de uma terceira e quarta geração de fotossensibilizadores (por exemplo, co-encapsulamento de inibidores de vias de sobrevivência de células tumorais com fotossensibilizadores de segunda geração). A presente tese descreve a avaliação e a comparação entre os ftalocianines metalados (ZnPC e AlPC) encapsulados em lipossomas com alvo para o interstício tumoral (ITLs), e os seus equivalentes hidrofílicos (ZnPCS4 e AlPCS4). Para isso, iniciamos a investigação através de uma avaliação in vitro usando células A431 como modelo para células tumorais, com uma disfunção no gene supressor tumoral P53 e superexpressão do receptor de factor de crescimento epidermal (EGFR). Como metodologia numa primeira abordagem foi avaliada a toxicidade no escuro (sem luz de ativação para a PDT) em função da concentração de fotossensibilizadores, utilizando os corantes WST-1 e sulforrodamina B como indicação da viabilidade celular. Seguiu-se o registo da captura celular em detrimento do tempo de exposição com os fotossensibilizadores, e também da sua distribuição a nível intracelular. Ambos os parâmetros foram determinados através da técnica de citometria de fluxo e de microscopia confocal, usando a fluorescência intrínseca dos fotossensibilizadores. Os valores de LC50 foram então estabelecidos para cada PS a um cumprimento de onda de 671 nm e uma exposição radiante de 15 J/cm2, após 1 hora de exposição com os fotossensibilizadores. Finalizamos o nosso primeiro estudo com a avaliação da morte celular em função do tempo pós-PDT, e também com a análise do ciclo celular 24 horas após a PDT. Através desta investigação observamos que, na ausência de iluminação, AlPC e ZnPC em ITLs não foram tóxicos para as células até uma concentração de 1,5 μM (exposição por até 72 h). No entanto, AlPCS4 e ZnPCS4 demonstraram toxicidade no escuro na ordem dos 5 μM e dos 2,5 μM, respetivamente. A absorção de todos os fotossensibilizadores foi observada tão cedo quanto 1 min após a adição de fotossensibilizadores às células, e aumentou em amplitude durante um período de incubação de 2 h. Porém, após 60 min de incubação com os fotossensibilizadores, todo o espaço não nuclear da célula foi fotossensibilizado, com a acumulação dos fotossensibilizadores em múltiplas estruturas subcelulares, especialmente no caso de AlPC e AlPCS4. A PDT de células fotossensibilizadas com ZnPC, AlPC e AlPCS4 foi capaz de produzir valores de LC50 na ordem dos 0,13 μM, 0,04 μM e 0,81 μM, respetivamente (24 horas após PDT, com base no ensaios com sulforrodamina B). O ZnPCS4 não foi capaz de induzir fototoxicidade, o que foi igualmente observado nos resultados obtidos na análise da morte celular e também do ciclo celular. Nas 4 h após PDT, a morte celular resumiu-se principalmente à apoptose para ZnPC e AlPC, que foi gradualmente aumentada em células fotossensibilizadas com AlPC durante 8 h. Por sua vez, as células tratadas com ZnPC recuperaram nas 8 h após PDT em comparação com 4 h pós-PDT. O AlPCS4 foi capaz de induzir a morte celular de forma significativa por necrose para além da apoptose, sendo que a maior parte da morte celular já se havia manifestado 2 h após a PDT. Durante o período de 8 h, a morte celular por via necrótica que era inicialmente a mais predominante, mas foi perdendo para a morte celular apoptótica tardia. A sinalização de morte celular coincidiu com redução de células na fase G0/G1 (ZnPC, AlPC, AlPCS4) e com a redução da atividade celular na fase S (ZnPC, AlPC, AlPCS4) e fase G2 (ZnPC e AlPC) do ciclo celular. A interrupção do ciclo celular foi mais profunda em células que foram incubadas com AlPC e submetidas a PDT. Com a intenção de validar resultados prévios, foram delineadas experiências utilizando o nosso modelo comparativo com os quatro ftalocianines metalados numa linhagem representativa da população celular num tumor (células endoteliais, fibroblastos e macrófagos), e também utilizando células de colangiocarcinoma humano como representante de células cancerígenas. Para além de todos os parâmetros avaliados no estudo anterior, optou-se por dar um passo em frente na investigação, e foi avaliada também a toxicidade sistémica de cada fotossensibilizador em embriões de peixe-zebra (Danio rerio) e galinha (Gallus gallus domesticus). Além disso, determinou-se o risco de fototoxicidade da pele usando murganhos (Mus musculus) BALB/c nude como modelo in vivo. Um estudo piloto sobre a eficácia da PDT também foi realizado em murganhos nude BALB/c portadores de xenoenxertos humanos de cancro de mama triplo negativo (MDA-MB-231). Como principais resultados observou-se que todos os fotossensibilizadores ativos (exceto ZnPCS4) foram capazes de fotossensibilizar efetivamente células cancerígenas e células não cancerosas. Além disso, os fotossensibilizadores em estudo não induziram nenhuma toxicidade sistémica significativa em embriões de peixe-zebra e galinha. No entanto, ZnPCS4 e ZnPC em ITLs foram associados à fototoxicidade da pele, enquanto os fotossensibilizadores contendo alumínio não exerceram nenhuma fototoxicidade detetável no tecido cutâneo. Por último, ZnPC e AlPC encapsulados em ITLs são igualmente eficazes em reduzir o volume tumoral de xenoenxertos de cancro da mama humano em murganhos nude BALB/c, e foram superiores a outros fotossensibilizadores fora do grupo dos ftalocianines quando avaliados em detrimento da dose administrada por mol. Em resumo, as investigações envolvendo o ZnPCS4 para terapia fotodinâmica oncológica serão descontinuadas no nosso grupo, já que ZnPCS4 demonstrou-se menos eficaz comparativamente aos restantes fotossensibilizadores em estudo. Por outro lado, ZnPCS4 revelou também sinais alarmantes de fototoxicidade cutânea. Deste modo, através das investigações incluídas na presente tese de doutoramento concluímos que AlPC e o seu derivativo hidrofílico AlPCS4 são os fotossensibilizadores menos tóxicos e mais eficazes. Assim sendo, pretendem-se continuar com estes dois fotossensibilizadores em futuros estudos rumo ao desenvolvimento de uma plataforma integrando os ITLs juntamente com outro agente quimioterápico para o tratamento eficaz de tumores sólidos através da PDT.
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Terapia fotodinâmica Zinco-ftalocianine Alumínio-ftalocianine Lipossomas Toxicidade Fototoxicidade cutânea Eficácia terapêutica