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Mitochondrial genetic therapy in Parkinson’s disease
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia:: Outras Engenharias e Tecnologias | por |
| dc.contributor.advisor | Costa, Diana Rita Barata | |
| dc.contributor.advisor | Sousa, Fani Pereira de | |
| dc.contributor.author | Baptista, Cátia Marlene do Carmo | |
| dc.date.accessioned | 2018-11-21T10:48:44Z | |
| dc.date.available | 2018-11-21T10:48:44Z | |
| dc.date.issued | 2015-11-10 | |
| dc.date.submitted | 2015-9-30 | |
| dc.description.abstract | Mitochondria have their own genome, a circular double-stranded genome that encodes 13 proteins involved in electron transport and oxidative phosphorylation (OXPHOS). They are present in 10–100 copies per somatic cell and within the cell mitochondrial DNA (mtDNA) copies could be identical in sequence (homoplasmy) or wild-type and mutant mtDNA could exist in different ratios (heteroplasmy). Heteroplasmy occurs mainly because mtDNA is particularly susceptible to mutations due its proximity to reactive oxygen species (ROS) generation sites. MtDNA dysfunction is characterized by a defective OXPHOS where ATP demands are not reached. The phenotype of the mitochondrial disease depends on the mtDNA heteroplasmy, when a threshold in the region of 60–90% mutated mtDNAs is reached. The idea that mitochondrial dysfunction could influence Parkinson disease (PD) arose with the discovery of the mechanism of action of MPTP in the early 1980s that affected electron flow in Complex I (CI). Different CI related mutations have been associated with PD and two of them were identified in mtND1 gene. This fact makes the development of a mtND1 construct a very interesting approach for mitochondrial gene therapy (MGT) purposes in PD treatment. Throughout this year, it was developed a nanocarrier to transport a designed vector with possible application in MGT. The vector was constructed using pCAG-GFP plasmid and the mitochondrial gene ND1 and CaCO3 were developed for the directed transport of the plasmid towards mitochondria. This research development was divided into three main stages: i) construction of a vector using an OXPHOS CI gene, mtND1 and the pCAG-GFP plasmid; ii) study of different recombinant hosts to produce the pCAG-GFP-mtND1 vector; and iii) development of a formulation for the efficient pDNA delivery into mitochondria. The mtND1 construct was successfully obtained and inserted into different E. coli strains. The growth profiles were very similar between the strains, being observed sligth differences in the pDNA specific yields. The nanocarries obtained were biocompatible, displaying encapsulation efficiencies (EE) above 50%, sizes below 280 nm and positive zeta potential, making them very suitable for MGT. | eng |
| dc.description.abstract | A mitocôndria é um organelo celular que tem o seu próprio genoma, de cadeia dupla e circular que codifica 13 proteínas envolvidas no transporte de eletrões e fosforilação oxidativa. Estão presentes entre 10 e 100 cópias por célula somática e, dentro das células, as cópias de ADN mitocondrial (mtDNA) podem ser idênticas em sequência (homoplasmia) ou mtDNA “wild-type” e mutado podem existir em diferentes proporções (heteroplasmia). A heteroplasmia ocorre principalmente porque o mtDNA é particularmente suscetível a mutações, devido à sua proximidade a locais de geração de espécies reactivas de oxigénio. Alterações no mtDNA podem provocar disfunções no mecanismo de fosforilação oxidativa, onde as exigências de ATP não são atingidas. O fenótipo da doença mitocondrial depende da heteroplasmia do mtDNA, quando é atingido um valor de mtDNA mutado entre 60-90%. A ideia de que a disfunção mitocondrial poderia influenciar a doença de Parkinson surgiu com descoberta do mecanismo de ação do MPTP no início de 1980, que afeta o fluxo de eletrões no Complexo I. Diferentes mutações que afectam os genes que codificam as proteínas deste complexo têm sido associadas com a doença de Parkinson, duas delas sendo identificadas no gene mitocondrial ND1. Este facto faz com que o desenvolvimento de um vector com o gene mitocondrial ND1 seja uma abordagem muito interessante para aplicação na terapia génica mitocondrial (MGT) para o potencial tratamento da doença de Parkinson. No presente trabalho foi desenvolvido um sistema para transportar um vector, desenhado no laboratório, com possível aplicação em terapia génica mitocondrial. O vector foi construído usando o plasmídeo pCAG-GFP e o gene mitocondrial ND1. Posteriormente, nanopartículas de CaCO3 foram desenvolvidas para o seu transporte direccionado para a mitocôndria. O desenvolvimento deste projecto foi dividido em três etapas principais: i) construção do vector baseado na clonagem do gene mitocodrial ND1 no plasmídeo pCAG-GFP; ii) estudo de diferentes hospedeiros recombinantes para a amplificação do vector pCAG-GFP-mtND1; e iii) desenvolvimento de uma formulação adequada ao direccionamento do vector pCAG-GFP-mtND1 de forma eficiente para a mitocôndria. O vector pCAG-GFP-mtND1 foi inserido em diferentes estirpes de E. coli e os estudos de crescimento foram muito semelhantes entre as estirpes transformadas, tendo sido observadas apenas algumas diferenças nos rendimentos específicos. Os sistemas de entrega preparados, demonstraram ser biocompatíveis, com eficiências de encapsulação acima de 50%, tamanhos inferiores a 280 nm e potenciais zeta positivos tornando-os adequados para MGT. | por |
| dc.identifier.tid | 201639890 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/6459 | |
| dc.language.iso | eng | por |
| dc.subject | Doença de Parkinson | por |
| dc.subject | Mutações Mitocondriais | por |
| dc.subject | Nanopartículas | por |
| dc.subject | Terapia Génica Mitocondrial | por |
| dc.title | Mitochondrial genetic therapy in Parkinson’s disease | por |
| dc.title.alternative | Cloning mitochondrial gene ND1 | por |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | openAccess | por |
| rcaap.type | masterThesis | por |
| thesis.degree.name | 2º Ciclo em Biotecnologia | por |
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