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Abstract(s)
O elevado potencial da utilização de moléculas de DNA, na forma de plasmídeos, em terapias cujo objetivo é o tratamento ou a cura de várias doenças, tem sido comprovado por inúmeros estudos desenvolvidos recentemente. No entanto, a utilização deste tipo de moléculas em terapias como Vacinas de DNA e na Terapia Génica, exige que a sua produção seja realizada até se atingir a escala da grama e garantindo elevados níveis de pureza do plasmídeo. Para além disso, pretende-se que o processo seja realizado da forma mais económica possível, cumprindo sempre as diretrizes das agências reguladoras como por exemplo a FDA (Food and Drug Administration) e a EMEA (European Agency for the Evaluation of Medical Products).
Vários processos têm sido utilizados no processo de purificação de plasmídeos, quer para a sua separação de impurezas como restos celulares, proteínas, DNA genómico, etc., quer para separar as diferentes isoformas em que um plasmídeo se pode encontrar (linear, circular aberto ou superenrolado). Uma das técnicas que tem sido utilizado com sucesso é a cromatografia de troca aniónica. No entanto, o mecanismo de separação de plasmídeos por esta técnica não é, ainda, totalmente compreendido. Para além disso, devido a razões económicas, sugere-se que os processos cromatográficos sejam conduzidos em modo de sobrecarga, ou seja através da sobrecarga da coluna de cromatografia. Contudo, trabalhar em sobrecarga é consideravelmente mais complexo do que trabalhar em cromatografia linear e, até ao momento, não existem modelos adequados que prevejam o mecanismo do processo cromatográfico nestas condições. Deste modo, a previsão do comportamento das moléculas neste caso, bem como do resultado da separação através de cromatografia não é viável, sendo um dos principais obstáculos na conceção e implementação de unidades preparativas à escala industrial. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à cromatografia não linear tem um elevado interesse prático.
A análise termodinâmica dos processos de adsorção através da Microcalorimetria de Fluxo (FMC) tem vindo a ser utilizada para obter uma melhor compreensão das forças motrizes, dos mecanismos e das cinéticas envolvidas no processo de adsorção de biomoléculas em diferentes sistemas cromatográficos. Por isso, neste trabalho, através da utilização da microcalorimetria de fluxo, pretende-se compreender o mecanismo de adsorção de um plasmídeo na sua forma linear (ln pVAX1-LacZ) sobre um suporte cromatográfico de troca aniónica (Fast Flow Q-sepharose). Os ensaios foram levados a cabo de modo a que o processo possa ser avaliado em condições lineares e em condições de sobrecarga. Para além do estudo do processo de adsorção tendo em conta a interação entre a biomolécula e o suporte cromatográfico, foi também considerada e avaliada a presença e a influência de efeitos não específicos como por exemplo a reorientação da biomolécula. Para além da microcalorimetria de fluxo, para obter uma melhor compreensão do mecanismo de adsorção, foram também realizados estudos da capacidade de ligação em modo estático (static binding capacity), microcalorimetria de titulação (Isothermal Titration Microcalorimetry) bem como estudos cromatográficos (fast performance chromatography). Os resultados obtidos nos estudos de capacidade de ligação revelaram que o processo de adsorção do plasmídeo segue uma isotérmica de Langmuir, em que a capacidade de ligação da Q-sepharose aumenta com o aumento da concentração de plasmídeo em equilíbrio até se atingir um patamar em que a saturação do suporte cromatográfico é atingida. Os estudos realizados utilizando a microcalorimetria de fluxo foram efetuados nas zonas linear, de transição e de sobrecarga tendo em conta a isotérmica construída. A injeção das amostras for realizada de dois modos diferentes, através da introdução de um pulso de amostra na célula do microcalorímetro ou através da alimentação contínua de amostra na célula. Estes modos de injeção foram conseguidos utilizando loops de diferentes volumes. Todos os termogramas obtidos são compostos por um primeiro pico endotérmico seguido de um pico exotérmico, o qual, em alguns casos específicos (sobrecarga de volume) resulta de picos sobrepostos. Para os picos endotérmicos o processo de dessolvatação foi sugerido como sendo o principal contribuinte enquanto que para o caso dos picos exotérmicos a interação entre o DNA e o suporte cromatográfico e a adsorção secundária foram apontados como os principais contribuidores. Para além disso, a microcalorimetria de fluxo sugere que o processo global de adsorção é exotérmico, o que é esperado uma vez que se trata de uma interação de troca aniónica. No entanto, foram também demonstradas evidências da presença de efeitos não específicos do processo de adsorção, nomeadamente a reorientação e a repulsão electroestática entre as moléculas adsorvidas.
The potential of plasmid DNA as a therapeutic molecule in the cure of several diseases has been sustained by innumerous studies. The use of pDNA in therapies (DNA Vaccines and Gene Therapy) requires its production at the gram scale, with high purity levels and in an economic way, always taking into account the guidelines from the regulatory agencies. Anion-exchange chromatography have been successfully used in pDNA purification. Nevertheless, the mechanism of pDNA separation using this technique is still not completely understood. Additionally, due to economic reasons, it may be interesting to run the chromatographic processes in the overloaded mode. However, the overloaded mode is considerably more complex than linear chromatography, and suitable models do not exist. Thus, the prediction of separation behavior is generally unreliable, being a major impediment in the design and implementation of scaled-up units. Therefore, a better understanding of the mechanisms underlying non-linear chromatography of biomolecules has considerable practical interest. Flow Microcalorimetry (FMC) has proven its ability to provide an improved understanding of the driving forces, mechanisms and kinetics involved in the adsorption process of biomolecules onto several chromatographic systems. Thus, using FMC as a central technique, this study aims to understand the adsorption mechanism of pDNA (pVAX1-LacZ) onto the anion-exchange support Fast Flow Q-sepharose, considering linear and overloaded conditions and showing the role of nonspecific effects at the adsorptive process. Static binding capacity, Isothermal Titration Microcalorimetry (ITM) and fast performance chromatography were also accomplished to obtain a better understanding of the adsorption mechanism. Static binding capacity studies revealed that the mechanism of pDNA adsorption onto Q-sepharose follows a Langmuir-type isotherm profile. FMC experiments were performed in the linear, transition and overloaded zones of the isotherm, through a pulse injection or a continuous feed. All obtained thermograms comprised a first endothermic peak followed by an exothermic peak which, in some cases (volume overloading), resulted from overlapped peaks. Endothermic heat major contributor was suggested to be the desolvation process. Exothermic heats were related to the interaction between pDNA and Q-sepharose primary and secondary adsorption. Furthermore, FMC revealed that the overall adsorption process is exothermic, as expected for an anion-exchange interaction. Nevertheless, there are evidences of the presence of nonspecific effects, such as reorientation and electrostatic repulsive forces.
The potential of plasmid DNA as a therapeutic molecule in the cure of several diseases has been sustained by innumerous studies. The use of pDNA in therapies (DNA Vaccines and Gene Therapy) requires its production at the gram scale, with high purity levels and in an economic way, always taking into account the guidelines from the regulatory agencies. Anion-exchange chromatography have been successfully used in pDNA purification. Nevertheless, the mechanism of pDNA separation using this technique is still not completely understood. Additionally, due to economic reasons, it may be interesting to run the chromatographic processes in the overloaded mode. However, the overloaded mode is considerably more complex than linear chromatography, and suitable models do not exist. Thus, the prediction of separation behavior is generally unreliable, being a major impediment in the design and implementation of scaled-up units. Therefore, a better understanding of the mechanisms underlying non-linear chromatography of biomolecules has considerable practical interest. Flow Microcalorimetry (FMC) has proven its ability to provide an improved understanding of the driving forces, mechanisms and kinetics involved in the adsorption process of biomolecules onto several chromatographic systems. Thus, using FMC as a central technique, this study aims to understand the adsorption mechanism of pDNA (pVAX1-LacZ) onto the anion-exchange support Fast Flow Q-sepharose, considering linear and overloaded conditions and showing the role of nonspecific effects at the adsorptive process. Static binding capacity, Isothermal Titration Microcalorimetry (ITM) and fast performance chromatography were also accomplished to obtain a better understanding of the adsorption mechanism. Static binding capacity studies revealed that the mechanism of pDNA adsorption onto Q-sepharose follows a Langmuir-type isotherm profile. FMC experiments were performed in the linear, transition and overloaded zones of the isotherm, through a pulse injection or a continuous feed. All obtained thermograms comprised a first endothermic peak followed by an exothermic peak which, in some cases (volume overloading), resulted from overlapped peaks. Endothermic heat major contributor was suggested to be the desolvation process. Exothermic heats were related to the interaction between pDNA and Q-sepharose primary and secondary adsorption. Furthermore, FMC revealed that the overall adsorption process is exothermic, as expected for an anion-exchange interaction. Nevertheless, there are evidences of the presence of nonspecific effects, such as reorientation and electrostatic repulsive forces.
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Keywords
Adsorption Anion Exchange Chromatography. Flow Microcalorimetry Isotherms Plasmid Dna