Production and purification of the proteins E3-14.7K and FIP-1: study of the molecular and cellular interactions

Duarte, Aida Maria Dâmaso

Publication

Production and purification of the proteins E3-14.7K and FIP-1: study of the molecular and cellular interactions

2009Master thesis

datacite.subject.fos	Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química	pt_PT
dc.contributor.advisor	Midoux, Patrick
dc.contributor.advisor	Pichon, Chantal
dc.contributor.advisor	Passarinha, Luís António Paulino
dc.contributor.author	Duarte, Aida Maria Dâmaso
dc.date.accessioned	2015-11-25T10:11:17Z
dc.date.available	2015-11-25T10:11:17Z
dc.date.issued	2009
dc.description.abstract	The aim of this study was to produce and purify the E3-14.7K adenovirus protein and its intracellular FIP-1 protein, in order to study their molecular interactions, their relationship with microtubules, and respective implication in apoptosis cycle. For this purpose, we have produced and purified five recombinants proteins: GST-FIP-1, E3-14.7K, and their fluorescent counterparts: EGFP-FIP-1, Cherry-FIP-1 and E3-Cherry, fused with EGFP or Cherry labels. We have constructed the pGST-FIP-1 plasmid by cloning the FIP-1 gene into the pGEX-6P-2 vector, in order to purify GST-FIP-1 protein by affinity chromatography with, GST BindTM Kits (Novagen). By this technique, this protein was purified with 95% of purity. All the other proteins, containing a 6 His-tag, were purified by affinity chromatography using His.Bind® Purification Kit (Novagen) based on an immobilized metal affinity chromatography (IMAC) method in native conditions. All these proteins were expressed in Escherichia coli Arctic ExpressTM competent cells. Typically it was observed that E3-14.7K protein forms inclusion bodies but the protein was successfully purified with 91% of purity when the extraction was performed in the presence of 0.5 M urea. The purification of the fluorescent proteins (EGFP-FIP-1, E3-Cherry and Cherry-FIP-1) failed to remove all contaminants, however their fluorescent properties exhibited a good emission spectrum. These fluorescent proteins will be of particular interest for studying their intracellular trafficking and interactions by confocal microscopy. These will constitute innovative tools for future researches, especially concerning to the apoptosis cycle.	pt_PT
dc.description.abstract	O objectivo deste trabalho consiste em produzir e purificar a proteína E3-14.7K e a proteína intracelular FIP-1, com o fim de estudar as suas interacções moleculares, a relação com os microtubulos e a sua respectiva implicação na apoptose. Para este efeito, produziu-se e purificou-se cinco proteínas recombinantes: GST-FIP-1, E3-14.7K, proteínas homologas fluorescentes nomeadamente: EGFP - FIP-1, Cherry-FIP-1 e E3- Cherry. A construção do plasmídeo pGST-FIP-1 foi realizada clonando o gene FIP-1 e inserindo-o no vector pGEX-6P-2, com fim de purificar a proteína GST-FIP-1 através de cromatografia afinidade com GST BindTM Kits (Novagen). Através desta técnica, a proteína foi purificada com 95% de pureza. Todas as outras proteínas, contendo a 6 Histag, foram purificados por cromatografia de afinidade utilizando His.Bind® Purification Kit (Novagen) baseado na immobilized metal affinity chromatography (IMAC) em condições nativas. Todas estas proteínas foram expressas em Escherichia coli Arctic ExpressTM competent cells. Neste trabalho observou-se que a proteína E3-14.7K forma habitualmente corpos de inclusão, no entanto foi purificada com sucesso, em cerca de 91% de pureza. A sua extracção foi realizada em presença de uma concentração de 0.5 M de ureia. Na purificação das proteínas fluorescentes (EGFP-FIP-1, E3-Cherry e Cherry-FIP-1) não foi possível remover todos os contaminantes presentes, no entanto conseguiu-se obter um espectro de emissão de fluorescência razoável. Estas proteínas têm um particular interesse, para o estudo das suas interacções, no tráfico intracelular através da microscopia confocal, o que consiste numa inovação na investigação, especialmente em relação à apoptose.
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10400.6/3929
dc.language.iso	eng	pt_PT
dc.subject	Proteína intercelular FIP-1	pt_PT
dc.subject	Proteína E3-14.7K	pt_PT
dc.subject	Adenovírus	pt_PT
dc.subject	Interacção de proteínas	pt_PT
dc.subject	Proteínas - Produção e purificação	pt_PT
dc.title	Production and purification of the proteins E3-14.7K and FIP-1: study of the molecular and cellular interactions	pt_PT
dc.type	master thesis
dspace.entity.type	Publication
rcaap.rights	openAccess	pt_PT
rcaap.type	masterThesis	pt_PT
thesis.degree.name	Mestrado em Bioquímica	pt_PT