Publication
Recombinant pre-miRNA-29b: Extracellular production and purification
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia::Biotecnologia | por |
| dc.contributor.advisor | Sousa, Fani Pereira de | |
| dc.contributor.advisor | Carapito, Ana Rita Mugeiro | |
| dc.contributor.advisor | Cruz, Carla Patrícia Alves Freire Madeira da | |
| dc.contributor.author | Bento, José Pedro Santos | |
| dc.date.accessioned | 2025-01-28T11:10:22Z | |
| dc.date.available | 2025-01-28T11:10:22Z | |
| dc.date.issued | 2024-12-05 | |
| dc.date.submitted | 2024-10-09 | |
| dc.description.abstract | A terapia baseada em RNA tem avançado rapidamente, trazendo desenvolvimentos promissores para o tratamento de diversas doenças. Os RNAs podem ser divididos em codificantes e não codificantes (ncRNAs), sendo que os não codificantes têm vindo a ganhar grande interesse visto que possuem a função de regulação da expressão génica. Os microRNAs (miRNAs ou miRs) são um exemplo de ncRNAs, que regulam a expressão génica a nível pós-transcricional e controlam processos biológicos com precisão notável, ligando-se de forma complementar aos mRNAs alvo, modulando assim a expressão génica. O pre-miRNA-29b é um desses miRNAs e já é reconhecido por estar envolvido nos mecanismos patológicos associados à doença de Alzheimer. Neste caso, os baixos níveis de miRNA-29b em doentes de Alzheimer, associado à expressão elevada da proteína BACE1, leva à acumulação dos péptidos Aß, que podem depositar, conduzindo à degeneração dos neurónios, comprometendo a função cognitiva. Logo este pre-miRNA-29b pode ser considerado como potencial biomarcador ou agente terapêutico para esta doença. Mas neste momento a produção em larga escala de RNA para aplicações terapêuticas envolve um processo complexo que exige estratégias de produção e purificação eficientes e controlo de qualidade rigoroso para garantir a pureza e a atividade biológica do RNA. No entanto, os métodos mais comuns para a produção de RNA são a síntese química ou enzimática, que apresentam limitações em termos de quantidade e qualidade do RNA produzido. Nesse contexto, a produção recombinante pode ser uma alternativa para superar alguns desses desafios, uma vez que é um método mais económico e de fácil transposição para larga escala. Foi escolhida a bactéria Rhodovulum sulfidophilum, que é uma bactéria púrpura marinha, que apresenta a vantagem de secretar RNAs para o meio extracelular, sem libertar RNases. Com isso, a recuperação do RNA pode ser consideravelmente simplificada em comparação com os protocolos padrão de extração intracelular, facilitando o subsequente processo de purificação, que é a etapa mais crítica e dispendiosa de todo o processo de preparação de RNAs. Este trabalho teve como foco a otimização da produção extracelular de pre-miRNA-29 assim como a sua subsequente purificação. As condições de crescimento bacteriano foram otimizadas de forma a garantir os níveis máximos da molécula alvo, monitorizando a produção em diferentes tempos de cultura (24 h, 36 h, 48 h e 60 h) e usando diferentes temperaturas (25 ºC, 30 ºC e 37 ºC) para o crescimento bacteriano. De modo geral, os níveis mais elevados de pre-miRNA-29b foram obtidos após 48 horas de crescimento a 25 ºC (0.23 ng/mL de meio), porém, para a continuidade dos estudos, foi escolhida a segunda melhor condição, de 36 horas de cultura a 30 ºC (0.08 ng/mL de meio), uma vez que o erro associado às medições nesta condição era menor, e consistia num tempo de cultura mais curto, rentabilizando assim a duração do processo. Quanto à purificação do pre-miRNA-29b, foi selecionado um suporte cromatográfico multimodal, Capto Q Impres, que demonstrou um desempenho promissor na interação seletiva com o RNA alvo. Realizou-se uma otimização inicial para avaliar o impacto da concentração de NaCl nas etapas de ligação e eluição, assim com o pH usado (7 ou 8) Adicionalmente, foi testado o efeito da pré-purificação da amostra por cromatografia de exclusão molecular e também analisada a importância de concentração da amostra antes de prosseguir para o passo de purificação. Foram ainda realizadas comparações quanto à massa de amostra aplicada na coluna, bem como a análise das diferenças entre as amostras intracelulares e extracelulares. Após a avaliação preliminar, foi aplicado um DoE na tentativa de melhorar o desempenho do processo de purificação. Os parâmetros de otimização incluíram a concentração de NaCl durante as etapas de equilíbrio e eluição, bem como o pH do tampão. Desta forma foi possível otimizar o processo de produção extracelular de pre-miRNA-29b em Rhodovulum sulfidophilum e também desenvolver um processo promissor para a sua posterior purificação. | eng |
| dc.description.abstract | RNA-based therapies have advanced rapidly, offering promising developments for the treatment of various diseases. Pre-miRNA-29b is already recognized for its involvement in one of the mechanisms underlying Alzheimer's disease. Large-scale production of RNA for therapeutic applications involves a complex process that requires efficient production and purification strategies, alongside rigorous quality control, to ensure the purity and biological activity of the RNA. However, the most used methods face limitations in terms of the quantity and quality of the RNA produced. In this context, recombinant production offers a potential alternative to overcome some of these challenges, as it is a more cost-effective method and easier to scale up. Rhodovulum sulfidophilum, a marine purple bacterium, has the advantage of secreting RNAs into the extracellular medium without releasing RNases. This significantly simplifies the RNA recovery compared to standard intracellular extraction protocols, facilitating the subsequent purification process, which is the most critical and costly step of the global biomanufacturing process. This work focused on optimizing the extracellular production of pre-miRNA-29b and its subsequent purification. Bacterial growth conditions were optimized to ensure maximum levels of the target molecule, monitoring production across different culture times (24 h, 36 h, 48 h, and 60 h) and temperatures (25 ºC, 30 ºC, and 37 ºC). In general, the highest levels of pre-miRNA-29b were achieved after 48 hours of growth at 25 ºC (0.23 ng/mL of medium). However, for the following studies, the second-best condition, 36 hours of culture at 30 ºC (0.08 ng/mL of medium), was chosen as it had a lower variability between assays and offered a shorter culture time, thereby improving process efficiency. For the purification of pre-miRNA-29b, a multimodal chromatographic support, Capto Q ImpRes, was selected, showing promising performance in selectively interacting with the target RNA. An initial optimization was conducted to evaluate the impact of varying NaCl concentration during the binding and elution steps, as well as the effect of buffer pH (7 or 8). Additionally, the effect of a pre-purification by size-exclusion chromatography column was tested, along with assessing the importance of concentrating the sample before purification. Comparisons were also made regarding the sample mass loaded onto the column and the differences between intracellular and extracellular samples were also addressed. After this preliminary evaluation, a Design of Experiments (DoE) was applied to further refine the performance of the purification process. The optimization parameters included NaCl concentration during the binding and elution steps, as well as buffer pH. This approach enabled the optimization of the extracellular production of pre-miRNA-29b in Rhodovulum sulfidophilum, while also developing a promising strategy for its subsequent purification. | eng |
| dc.identifier.tid | 203830334 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/15048 | |
| dc.language.iso | eng | por |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ | |
| dc.subject | Desenho Experimental | por |
| dc.subject | Pre-Mirna-29b | por |
| dc.subject | Produção Recombinante | por |
| dc.subject | Purificação | por |
| dc.subject | Rhodovulum Sulfidophilum | por |
| dc.title | Recombinant pre-miRNA-29b: Extracellular production and purification | por |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | openAccess | por |
| rcaap.type | masterThesis | por |
| thesis.degree.name | 2º Ciclo em Biotecnologia | por |
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