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Abstract(s)
The choroid plexus (CP), localized within brain ventricles, constitutes the barrier between the blood and the cerebrospinal fluid (CSF) and is an essential structure for the maintenance of brain homeostasis. It participates in the synthesis, secretion and regulation of the CSF and various biologically active compounds, in the maintenance of central nervous system (CNS) metal bioavailability and in the removal of brain toxic compounds, protecting it against neurotoxic insults.
Transthyretin (TTR) is a homotetrameric protein mostly produced and secreted by the liver to the peripheral circulation and by the CP epithelial cells (CPECs) to the CSF. The TTR major functions are the transport of thyroid hormones, principally thyroxin, and, indirectly, retinol. Furthermore, in the last decades, it has also been shown that TTR acts as an amyloid-beta (Aβ) peptide scavenger, a key molecule in Alzheimer’s disease (AD), preventing its aggregation and/or deposition and promoting its clearance. Actually, the non-mutated form of TTR has been identified as the main Aβ binding protein in the CSF.
Metallothioneins (MTs) are multipurpose proteins with widely described metal binding, antioxidant and anti-inflammatory properties. In mammals, four distinct isoforms had been identified (MT-1 to MT-4). In addition, other physiological actions have also been attributed to MTs: inhibition of pro-apoptotic mechanisms, enhancement of cell survival and tissue regeneration. Previous studies showed that the expression of brain MTs is regulated in several neurodegenerative disorders, as AD, and MT-1/2, contrarily to MT-3, are highly inducible by physiological and psychological stress.
TTR and MTs act in several metabolic pathways, especially within the CNS, where they play major roles in its homeostasis. Previously, our group showed that TTR interacts with MT-2, an ubiquitous isoform of the MTs, with unknown effects on the functions of each protein. Thus, we firstly investigated whether it also interacts with MT-3, an isoform predominantly expressed in the brain, and studied the role of MT-2 and MT-3 in human TTR–Aβ binding. The TTR–MT-3 interaction was characterized by yeast two-hybrid assays, saturation-binding assays, co-immunolocalization and co-immunoprecipitation assays. Moreover, the effect of MT-2 and MT-3 in TTR–Aβ binding was assessed by competition-binding assays. The results demonstrated that TTR interacts with MT-3 with a dissociation constant (Kd) of 373.7 ± 60.2 nM. Also, TTR-MT-2 interaction diminished the TTR–Aβ binding, whereas MT-3 enhanced the binding of TTR to Aβ, most likely promoting its degradation. Furthermore, both proteins co-localized with the endoplasmic reticulum of CPECs, indicating that, as TTR, MTs may also be secreted and interactions between TTR and MTs might occur inside and outside these cells.
Stress is related with neurodegenerative disorders because it raises glucocorticoid levels, which generate adequate responses to stressors and regulate key molecules, as TTR and MT-1/2, in some brain regions, participating in neuroprotection and neuroregeneration. However, in CP, nothing is known concerning the regulation of TTR and MT-1/2 expressions by glucocorticoids. In silico analyses of TTR and MT-1/2 genes identified glucocorticoid responsive elements (GREs) in both genes. Also, CP expresses TTR, MTs (isoforms 1, 2 and 3) and glucocorticoid and mineralocorticoid receptors (GR and MR, respectively) turning it into a likely glucocorticoid responsive tissue. Thus, we hypothesized that TTR and MT-1/2 could be regulated by glucocorticoids within the CP. We investigated the regulation of TTR expression in response to hydrocortisone in a rat choroid plexus (RCP) cell line and in primary cultures of CPECs. In addition, the effect of psychosocial stress induction in TTR expression was analyzed in rat liver, CP and CSF. The results showed that hydrocortisone up-regulated TTR expression in RCP and CPEC cultures, and, this effect was suppressed upon addition of GR and/or MR antagonists, suggesting the involvement of these receptors in this regulatory mechanism. Moreover, induction of psychosocial stress increased TTR expression in liver, CP and CSF of animals subjected to acute or chronic stress conditions, showing that stress up-regulates TTR expression, particularly in CP.
To test the hypothesis that MT-1/2 expression in CP could also be regulated by glucocorticoids, with implications in apoptosis, we performed analogous experiments to those described above. Data obtained showed that hydrocortisone up-regulated MT-1/2 expression in RCP cells and CPECs and the incubation with GR and/or MR antagonists abrogated this effect. In addition, comparing to controls, the incubation of RCP cells with hydrocortisone diminished the ratio of apoptotic/late apoptotic cells from 17.8% to 9.7% and, this effect was abolished by the addition of an anti-MT-1/2 antibody. Thus, the up-regulation of MT-1/2 expression after incubation with glucocorticoids diminished apoptosis in CP and in this regard, glucocorticoids may beneficiate CP integrity and therefore become neuroprotective. In vivo studies showed that induction of chronic psychosocial stress increased MT-1/2 expression in liver and CP of male and female rats. A similar pattern was observed after acute stress in liver. Interestingly, in CP, induction of acute stress caused different effects between genders as, in females, it promoted an up-regulation of MT-1/2 expression, while a down-regulation was observed in males, indicating a distinct regulation gender-dependent and, suggesting distinct readjustment in response to stress between males and females in this structure. Generally, results showed that glucocorticoids regulate MT-1/2 expression in rat CP, time-, tissue- and gender-dependently, with implications in apoptosis.
Numerous pathways and molecules and its complex interactions are involved in neurodegenerative disorders. In line with this, we suggest that the putative and isolated
neuroprotective effects promoted by glucocorticoids in CP may not be sufficient per se to prevent the negative effects promoted by high levels of cortisol in other brain regions, other
molecules or in the overall progression of a disease. Taken together, our results suggest that the up-regulation of TTR and MT-1/2 in CP, promoted by glucocorticoids, also result in a higher bioavailability of these proteins that may potentiate the occurrence of TTR-MT-2 interactions, which negatively affect the Aβ clearance and, consequently, AD. Future studies will be crucial for clarification of the role of these molecules and their interactions with Aβ metabolism and apoptosis, which may have far reaching effects in various neurodegenerative disorders, as AD.
Os plexus coroideus (CP) são estruturas cerebrais muito vascularizadas, que se projectam para o interior dos ventrículos e constituem a barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano (CSF). Têm como principal função a secreção de CSF. Para além disso, durante o desenvolvimento e o envelhecimento, participam na síntese, secreção e regulação dos compostos biologicamente activos do CSF, na manutenção da biodisponibilidade de metais no cérebro e na remoção dos seus compostos tóxicos, protegendo-o contra insultos neurotóxicos. Por estes motivos, os CP são estruturas essenciais para a manutenção da homeostasia no cérebro. A transtiretina (TTR) é uma proteína homotetramérica maioritariamente produzida pelos hepatócitos e pelas células epiteliais dos CP (CPECs) e secretada, respectivamente, para a circulação sanguínea e para o CSF, no qual, corresponde a cerca de 25% do seu conteúdo proteico total. Inicialmente, a TTR foi descrita como sendo uma proteína transportadora de hormonas tiróideias, principalmente a tiroxina, e, indirectamente, de retinol (vitamina A), através da sua ligação à proteína de ligação do retinol. Nas últimas décadas, outras importantes funções têm sido atribuídas à TTR: foi demonstrado que a TTR é a principal proteína de ligação ao péptido beta-amilóide (Aβ) no CSF, que é uma molécula chave na doença de Alzheimer (AD), actuando como seu sequestrador, impedindo a sua agregação e/ou deposição e promovendo a sua eliminação. Esta propriedade parece ter implicações clínicas já que na AD, a expressão de TTR se encontra diminuida. As metalotioneínas (MTs) são proteínas polivalentes, de ligação a metais com funções antioxidantes e anti-inflamatórias amplamente descritas. Em mamíferos, existem quatro isoformas descritas (MT-1 a MT-4). Para além das funções já mencionadas, vários autores têm atribuído às isoformas 1/2 e 3 outras acções fisiológicas ao nível do sistema nervoso central (CNS), nomeadamente: a inibição de mecanismos pró-apoptóticos principalmente através da captação de espécies reactivas de oxigénio; o aumento da sobrevivência celular; a regeneração de tecidos; e, o controlo dos níveis de iões metálicos envolvidos na agregação do péptido Aβ. Estudos anteriores mostraram que as MTs expressas no cérebro se encontram diferencialmente reguladas em várias doenças neurodegenerativas, sendo que, contrariamente à MT-3, as isoformas MT-1 e MT-2, são altamente induzidas pelo stress. De facto, numerosos agentes, tais como metais, citocinas, agentes oxidantes, hormonas e uma variedade de outras moléculas promotoras de stress fisiológico e/ou psicológico são reguladores eficientes da expressão de MT-1/2 em algumas regiões do cérebro. A TTR e as MTs intervêm em numerosas vias metabólicas e desempenham diversas funções ao nível do CNS, sendo, por isso, consideradas proteínas bastante relevantes no seu funcionamento. Um estudo prévio realizado pelo nosso grupo mostrou que a TTR interage com a MT-2, com efeitos desconhecidos ao nível das funções isoladas de cada proteína. Assim, numa primeira abordagem, investigou-se a ocorrência de interacção entre a TTR e a MT-3, uma isoforma predominantemente expressa no cérebro, e estudou-se o efeito das interacções TTR-MT-2/MT-3 de two-hybrid em leveduras, ensaios de saturação in vitro, ensaios de co-imunoprecipitação e ensaios de co-imunolocalização. Para avaliar os possíveis efeitos destas interacções na ligação da TTR ao Aβ, realizaram-se ensaios de competição in vitro. Da análise dos resultados obtidos concluiu-se que a TTR interage com a MT-3 com uma constante de dissociação (Kd) de 373,7 ± 60,2 nM e que a ligação da TTR à MT-2 ou à MT-3 afecta o metabolismo do Aβ. Especificamente, observou-se que, a MT-2 desfavoreceu a ligação da TTR ao Aβ, enquanto a MT-3 potenciou esta mesma ligação. Para além disso, os ensaios de co-imunolocalização mostraram que ambas as proteínas co-localizam com o retículo endoplasmático das CPECs, sobretudo na região perinuclear, sugerindo que as MTs, tal como a TTR, são secretadas, podendo estas interacções ocorrer dentro e fora destas células. Este estudo mostrou-se bastante relevante na medida em que serviu não só para a identificação de um novo ligando da TTR como também para mostrar que, na presença de MT-2 ou MT-3, a ligação TTR-Aβ é afectada. Assim, deste estudo emergiram novas perspectivas para a clarificação dos mecanismos implicados na ligação da TTR ao Aβ na presença de MT-2 e/ou MT-3 e surgiu a necessidade de esclarecer se os efeitos das interacções TTR-MT-2 e TTR-MT-3 na ligação TTR-Aβ também ocorrem, e são relevantes, in vivo, em modelos animais de AD e, em caso afirmativo, identificar especificamente os mecanismos envolvidos. Numerosos estudos têm identificado o stress como um factor ambiental, directa e/ou indirectamente, relacionado com várias doenças neurodegenerativas. O stress provoca aumentos dos níveis de glucocorticóides que, por sua vez, são capazes de gerar respostas adequadas aos seus agentes indutores, participando na neuroprotecção e neuroregeneração. Estudos prévios mostraram que altos níveis de glucocorticóides, induzidos pelo stress crónico, regulam a expressão de várias moléculas, incluindo a TTR e as MT-1/2 em algumas regiões do cérebro, e condicionam diversas neuropatologias como a perda de memória, a depressão, o stress fisiológico e a AD. No entanto, nos CP, não existe qualquer estudo no que respeita à regulação da expressão de TTR e MT-1/2 pelos glucocorticóides, nos quais podem gerar desequilíbrios na homeostasia dos metais e conduzir ao aumento do stress oxidativo e da apoptose nas suas células, podendo danificar a sua estrutura. Com base nos efeitos do stress ao nível do CNS e o papel dos CP na sua homeostasia, bem como o facto de TTR, MT-1/2 e receptores de glucocorticóides e mineralocorticóides (GR e MR, respectivamente) serem expressos pelas células dos CP, pesquisou-se a presença de elementos responsivos dos glucocorticóides (GREs) nos genes da TTR e da MT-1/2. Os resultados revelaram a presença de GREs em ambos os genes, sugerindo que ambas são proteínas potencialmente reguladas por estas hormonas. Neste contexto, estudou-se o efeito dos glucocorticóides na regulação da expressão de TTR e de MT-1/2, particularmente ao nível dos CP. Para tal, realizaram-se estudos in vitro incubando culturas primárias de CPECs e células de uma linha celular de CP de rato (RCP) com hidrocortisona, uma forma sintética do cortisol. Para além disso, estudou-se ainda a possibilidade desta regulação ocorrer através dos seus receptores, tendo-se procedido à incubação de células RCP com hidrocortisona, na presença e na ausência de antagonistas dos receptores GR e/ou MR (mifepristona/RU486 e spironolactona, respectivamente). Paralelamente, foram ainda efectuados estudos in vivo em ratos adultos (Wistar Han), machos e fêmeas, nos quais se provocou um aumento dos níveis de glucocorticóides, através da indução de um stress psicossocial (populacional) agudo ou crónico, e, posteriormente, se avaliou a expressão de TTR (fígado, CP e CSF) e de MT-1/2 (fígado e CP) ao nível da proteína e do mRNA por Western blot e PCR em tempo real, respectivamente. A análise dos resultados obtidos mostrou que a hidrocortisona promoveu o aumento da expressão de TTR em culturas celulares de RCP e CPECs, via GR e MR, dado que na presença de pelo menos um dos antagonistas destes receptores, este efeito não se verificou. Nas experiências de indução de stress psicossocial agudo ou crónico foi observado um consistente aumento na expressão de TTR no fígado, CP e CSF, em machos e em fêmeas, tendo esse aumento sido máximo nos machos após o stress agudo. De um modo geral, concluiu-se que o stress, com associados aumentos nos níveis de glucocorticóides circulantes, regula positivamente a expressão TTR, via GR e MR, particularmente ao nível dos CP. Nas experiências realizadas in vitro para testar a hipótese da expressão de MT-1/2 ser regulada pelos glucocorticóides, observou-se que a hidrocortisona induziu a expressão de MT-1/2 quer em células RCP quer em CPECs via GR e MR, dado que, também para a MT-1/2, a incubação com antagonistas de GR e/ou MR anulou este efeito. Os estudos in vivo mostraram um aumento consistente na expressão de MT-1/2 ao nível do fígado e CP, nos ratos machos e fêmeas, após a indução de um stress psicossocial crónico. O mesmo foi observado no fígado, após a indução do stress agudo. Pelo contrário, a indução de um stress psicossocial agudo, provocou efeitos distintos entre sexos ao nível da expressão de MT-1/2 nos CP, já que se observou uma sobrexpressão de MT-1/2 nas fêmeas, e o efeito oposto nos machos, sugerindo um papel preponderante do género, com consequentes diferenças nas respostas ao mesmo estímulo. Neste estudo foi ainda testada a hipótese da regulação da expressão de MT-1/2 pelos glucocorticóides ter implicações na apoptose. Para tal, realizaram-se ensaios de citometria de fluxo para determinação dos níveis de apoptose nas células RCP, decorrentes do estímulo da expressão de MT-1/2 pelos glucocorticóides. A análise dos resultados mostrou uma redução nos níveis de apoptose para cerca de metade (de 17,8% para 9,7%) na presença de MT-1/2, tendo este efeito sido revertido pela pré-incubação com anticorpo anti-MT-1/2. Assim, a sobrexpressão de MT-1/2 após a incubação com glucocorticóides diminuiu a apoptose das células de CP e, neste sentido, os glucocorticóides poderão promover a manutenção da integridade deste tecido e, por conseguinte, serem neuroprotectores nestas estruturas. De um modo geral, concluiu-se que a expressão de MT-1/2 nos CP é regulada pelos glucocorticóides, com implicações na apoptose, sendo esta regulação dependente do sexo e da duração do estímulo. As doenças neurodegenerativas encontram-se associadas a perturbações em numerosas vias, moléculas e suas interacções complexas. Uma dada molécula ou estímulo pode ser potenciador ou inibidor de uma determinada patologia dependendo de muitos outros aspectos, e alguns resultados contraditórios têm surgido ao longo dos anos. Estudos anteriores mostraram que níveis sistematicamente elevados de glucocorticóides perturbam a homeostasia do cérebro e estão, geralmente, associados a demências. No entanto, outros autores mostraram que estes aumentos também podem ser benéficos na medida em que podem prevenir o aparecimento/ progressão de algumas doenças neurodegenerativas e ter efeitos anti-inflamatórios em determinadas regiões do cérebro. De um modo geral, sugere-se que os efeitos neuroprotectores promovidos pelos glucocorticóides ao nível dos CP podem não ser suficientes, por si, para prevenir os efeitos adversos promovidos pelos elevados níveis de glucocorticóides noutras regiões do cérebro, na expressão de outras moléculas ou na progressão global de uma patologia. De facto, de acordo com os resultados obtidos, a regulação positiva da expressão de TTR e de MT-1/2, promovida pelos glucocorticóides, confere propriedades neuroprotectoras aos CP. No entanto, esta poderá originar também uma maior biodisponibilidade de TTR e MT-1/2 e favorecer a ocorrência de interacções TTR-MT-2 que, por sua vez, poderão contribuir para a acumulação de Aβ ao desfavorecerem a sua interacção com a TTR. Assim, o benefício versus dano de uma dada molécula numa determinada neuropatologia dependerá sempre do seu equilíbrio sendo o seu efeito final, o resultado dos seus impactos directo, na patologia, e indirecto, em outras moléculas também elas intervenientes. Em suma, os resultados acima descritos mostraram a ocorrência de uma interacção entre a TTR e a MT-3 e salientaram a importância da ocorrência de interacções TTR-MT-2 e TTR-MT-3 na ligação da TTR ao Aβ. Para além disso, mostrou-se a relevância dos glucocorticóides na regulação da expressão de TTR e MT-1/2, particularmente ao nível dos CP. Este trabalho não relaciona directamente os efeitos dos glucocorticóides na expressão de TTR ou de MT-1/2 com qualquer patologia específica. No entanto, a TTR e as MTs, bem como os glucocorticóides, são moléculas chave em diversas neuropatologias, como a AD, e, a TTR e a MT-2 ou MT-3 interagem e afectam o metabolismo do Aβ tornando-se, por isso, proteínas bastante promissoras para a investigação nesta área. Nesta perspectiva, estudos futuros que envolvam indução de stress/administração de glucocorticóides em modelos animais de AD cruzados com TTR knockout (KO) e/ou MT-1/2 e/ou MT-3 KO, com determinação dos níveis de Aβ no cérebro e análise do desempenho cognitivo, serão cruciais para a clarificação do papel destas moléculas no metabolismo do Aβ e na apoptose e, consequentemente, na progressão de certas doenças neurodegenerativas, como a AD.
Os plexus coroideus (CP) são estruturas cerebrais muito vascularizadas, que se projectam para o interior dos ventrículos e constituem a barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano (CSF). Têm como principal função a secreção de CSF. Para além disso, durante o desenvolvimento e o envelhecimento, participam na síntese, secreção e regulação dos compostos biologicamente activos do CSF, na manutenção da biodisponibilidade de metais no cérebro e na remoção dos seus compostos tóxicos, protegendo-o contra insultos neurotóxicos. Por estes motivos, os CP são estruturas essenciais para a manutenção da homeostasia no cérebro. A transtiretina (TTR) é uma proteína homotetramérica maioritariamente produzida pelos hepatócitos e pelas células epiteliais dos CP (CPECs) e secretada, respectivamente, para a circulação sanguínea e para o CSF, no qual, corresponde a cerca de 25% do seu conteúdo proteico total. Inicialmente, a TTR foi descrita como sendo uma proteína transportadora de hormonas tiróideias, principalmente a tiroxina, e, indirectamente, de retinol (vitamina A), através da sua ligação à proteína de ligação do retinol. Nas últimas décadas, outras importantes funções têm sido atribuídas à TTR: foi demonstrado que a TTR é a principal proteína de ligação ao péptido beta-amilóide (Aβ) no CSF, que é uma molécula chave na doença de Alzheimer (AD), actuando como seu sequestrador, impedindo a sua agregação e/ou deposição e promovendo a sua eliminação. Esta propriedade parece ter implicações clínicas já que na AD, a expressão de TTR se encontra diminuida. As metalotioneínas (MTs) são proteínas polivalentes, de ligação a metais com funções antioxidantes e anti-inflamatórias amplamente descritas. Em mamíferos, existem quatro isoformas descritas (MT-1 a MT-4). Para além das funções já mencionadas, vários autores têm atribuído às isoformas 1/2 e 3 outras acções fisiológicas ao nível do sistema nervoso central (CNS), nomeadamente: a inibição de mecanismos pró-apoptóticos principalmente através da captação de espécies reactivas de oxigénio; o aumento da sobrevivência celular; a regeneração de tecidos; e, o controlo dos níveis de iões metálicos envolvidos na agregação do péptido Aβ. Estudos anteriores mostraram que as MTs expressas no cérebro se encontram diferencialmente reguladas em várias doenças neurodegenerativas, sendo que, contrariamente à MT-3, as isoformas MT-1 e MT-2, são altamente induzidas pelo stress. De facto, numerosos agentes, tais como metais, citocinas, agentes oxidantes, hormonas e uma variedade de outras moléculas promotoras de stress fisiológico e/ou psicológico são reguladores eficientes da expressão de MT-1/2 em algumas regiões do cérebro. A TTR e as MTs intervêm em numerosas vias metabólicas e desempenham diversas funções ao nível do CNS, sendo, por isso, consideradas proteínas bastante relevantes no seu funcionamento. Um estudo prévio realizado pelo nosso grupo mostrou que a TTR interage com a MT-2, com efeitos desconhecidos ao nível das funções isoladas de cada proteína. Assim, numa primeira abordagem, investigou-se a ocorrência de interacção entre a TTR e a MT-3, uma isoforma predominantemente expressa no cérebro, e estudou-se o efeito das interacções TTR-MT-2/MT-3 de two-hybrid em leveduras, ensaios de saturação in vitro, ensaios de co-imunoprecipitação e ensaios de co-imunolocalização. Para avaliar os possíveis efeitos destas interacções na ligação da TTR ao Aβ, realizaram-se ensaios de competição in vitro. Da análise dos resultados obtidos concluiu-se que a TTR interage com a MT-3 com uma constante de dissociação (Kd) de 373,7 ± 60,2 nM e que a ligação da TTR à MT-2 ou à MT-3 afecta o metabolismo do Aβ. Especificamente, observou-se que, a MT-2 desfavoreceu a ligação da TTR ao Aβ, enquanto a MT-3 potenciou esta mesma ligação. Para além disso, os ensaios de co-imunolocalização mostraram que ambas as proteínas co-localizam com o retículo endoplasmático das CPECs, sobretudo na região perinuclear, sugerindo que as MTs, tal como a TTR, são secretadas, podendo estas interacções ocorrer dentro e fora destas células. Este estudo mostrou-se bastante relevante na medida em que serviu não só para a identificação de um novo ligando da TTR como também para mostrar que, na presença de MT-2 ou MT-3, a ligação TTR-Aβ é afectada. Assim, deste estudo emergiram novas perspectivas para a clarificação dos mecanismos implicados na ligação da TTR ao Aβ na presença de MT-2 e/ou MT-3 e surgiu a necessidade de esclarecer se os efeitos das interacções TTR-MT-2 e TTR-MT-3 na ligação TTR-Aβ também ocorrem, e são relevantes, in vivo, em modelos animais de AD e, em caso afirmativo, identificar especificamente os mecanismos envolvidos. Numerosos estudos têm identificado o stress como um factor ambiental, directa e/ou indirectamente, relacionado com várias doenças neurodegenerativas. O stress provoca aumentos dos níveis de glucocorticóides que, por sua vez, são capazes de gerar respostas adequadas aos seus agentes indutores, participando na neuroprotecção e neuroregeneração. Estudos prévios mostraram que altos níveis de glucocorticóides, induzidos pelo stress crónico, regulam a expressão de várias moléculas, incluindo a TTR e as MT-1/2 em algumas regiões do cérebro, e condicionam diversas neuropatologias como a perda de memória, a depressão, o stress fisiológico e a AD. No entanto, nos CP, não existe qualquer estudo no que respeita à regulação da expressão de TTR e MT-1/2 pelos glucocorticóides, nos quais podem gerar desequilíbrios na homeostasia dos metais e conduzir ao aumento do stress oxidativo e da apoptose nas suas células, podendo danificar a sua estrutura. Com base nos efeitos do stress ao nível do CNS e o papel dos CP na sua homeostasia, bem como o facto de TTR, MT-1/2 e receptores de glucocorticóides e mineralocorticóides (GR e MR, respectivamente) serem expressos pelas células dos CP, pesquisou-se a presença de elementos responsivos dos glucocorticóides (GREs) nos genes da TTR e da MT-1/2. Os resultados revelaram a presença de GREs em ambos os genes, sugerindo que ambas são proteínas potencialmente reguladas por estas hormonas. Neste contexto, estudou-se o efeito dos glucocorticóides na regulação da expressão de TTR e de MT-1/2, particularmente ao nível dos CP. Para tal, realizaram-se estudos in vitro incubando culturas primárias de CPECs e células de uma linha celular de CP de rato (RCP) com hidrocortisona, uma forma sintética do cortisol. Para além disso, estudou-se ainda a possibilidade desta regulação ocorrer através dos seus receptores, tendo-se procedido à incubação de células RCP com hidrocortisona, na presença e na ausência de antagonistas dos receptores GR e/ou MR (mifepristona/RU486 e spironolactona, respectivamente). Paralelamente, foram ainda efectuados estudos in vivo em ratos adultos (Wistar Han), machos e fêmeas, nos quais se provocou um aumento dos níveis de glucocorticóides, através da indução de um stress psicossocial (populacional) agudo ou crónico, e, posteriormente, se avaliou a expressão de TTR (fígado, CP e CSF) e de MT-1/2 (fígado e CP) ao nível da proteína e do mRNA por Western blot e PCR em tempo real, respectivamente. A análise dos resultados obtidos mostrou que a hidrocortisona promoveu o aumento da expressão de TTR em culturas celulares de RCP e CPECs, via GR e MR, dado que na presença de pelo menos um dos antagonistas destes receptores, este efeito não se verificou. Nas experiências de indução de stress psicossocial agudo ou crónico foi observado um consistente aumento na expressão de TTR no fígado, CP e CSF, em machos e em fêmeas, tendo esse aumento sido máximo nos machos após o stress agudo. De um modo geral, concluiu-se que o stress, com associados aumentos nos níveis de glucocorticóides circulantes, regula positivamente a expressão TTR, via GR e MR, particularmente ao nível dos CP. Nas experiências realizadas in vitro para testar a hipótese da expressão de MT-1/2 ser regulada pelos glucocorticóides, observou-se que a hidrocortisona induziu a expressão de MT-1/2 quer em células RCP quer em CPECs via GR e MR, dado que, também para a MT-1/2, a incubação com antagonistas de GR e/ou MR anulou este efeito. Os estudos in vivo mostraram um aumento consistente na expressão de MT-1/2 ao nível do fígado e CP, nos ratos machos e fêmeas, após a indução de um stress psicossocial crónico. O mesmo foi observado no fígado, após a indução do stress agudo. Pelo contrário, a indução de um stress psicossocial agudo, provocou efeitos distintos entre sexos ao nível da expressão de MT-1/2 nos CP, já que se observou uma sobrexpressão de MT-1/2 nas fêmeas, e o efeito oposto nos machos, sugerindo um papel preponderante do género, com consequentes diferenças nas respostas ao mesmo estímulo. Neste estudo foi ainda testada a hipótese da regulação da expressão de MT-1/2 pelos glucocorticóides ter implicações na apoptose. Para tal, realizaram-se ensaios de citometria de fluxo para determinação dos níveis de apoptose nas células RCP, decorrentes do estímulo da expressão de MT-1/2 pelos glucocorticóides. A análise dos resultados mostrou uma redução nos níveis de apoptose para cerca de metade (de 17,8% para 9,7%) na presença de MT-1/2, tendo este efeito sido revertido pela pré-incubação com anticorpo anti-MT-1/2. Assim, a sobrexpressão de MT-1/2 após a incubação com glucocorticóides diminuiu a apoptose das células de CP e, neste sentido, os glucocorticóides poderão promover a manutenção da integridade deste tecido e, por conseguinte, serem neuroprotectores nestas estruturas. De um modo geral, concluiu-se que a expressão de MT-1/2 nos CP é regulada pelos glucocorticóides, com implicações na apoptose, sendo esta regulação dependente do sexo e da duração do estímulo. As doenças neurodegenerativas encontram-se associadas a perturbações em numerosas vias, moléculas e suas interacções complexas. Uma dada molécula ou estímulo pode ser potenciador ou inibidor de uma determinada patologia dependendo de muitos outros aspectos, e alguns resultados contraditórios têm surgido ao longo dos anos. Estudos anteriores mostraram que níveis sistematicamente elevados de glucocorticóides perturbam a homeostasia do cérebro e estão, geralmente, associados a demências. No entanto, outros autores mostraram que estes aumentos também podem ser benéficos na medida em que podem prevenir o aparecimento/ progressão de algumas doenças neurodegenerativas e ter efeitos anti-inflamatórios em determinadas regiões do cérebro. De um modo geral, sugere-se que os efeitos neuroprotectores promovidos pelos glucocorticóides ao nível dos CP podem não ser suficientes, por si, para prevenir os efeitos adversos promovidos pelos elevados níveis de glucocorticóides noutras regiões do cérebro, na expressão de outras moléculas ou na progressão global de uma patologia. De facto, de acordo com os resultados obtidos, a regulação positiva da expressão de TTR e de MT-1/2, promovida pelos glucocorticóides, confere propriedades neuroprotectoras aos CP. No entanto, esta poderá originar também uma maior biodisponibilidade de TTR e MT-1/2 e favorecer a ocorrência de interacções TTR-MT-2 que, por sua vez, poderão contribuir para a acumulação de Aβ ao desfavorecerem a sua interacção com a TTR. Assim, o benefício versus dano de uma dada molécula numa determinada neuropatologia dependerá sempre do seu equilíbrio sendo o seu efeito final, o resultado dos seus impactos directo, na patologia, e indirecto, em outras moléculas também elas intervenientes. Em suma, os resultados acima descritos mostraram a ocorrência de uma interacção entre a TTR e a MT-3 e salientaram a importância da ocorrência de interacções TTR-MT-2 e TTR-MT-3 na ligação da TTR ao Aβ. Para além disso, mostrou-se a relevância dos glucocorticóides na regulação da expressão de TTR e MT-1/2, particularmente ao nível dos CP. Este trabalho não relaciona directamente os efeitos dos glucocorticóides na expressão de TTR ou de MT-1/2 com qualquer patologia específica. No entanto, a TTR e as MTs, bem como os glucocorticóides, são moléculas chave em diversas neuropatologias, como a AD, e, a TTR e a MT-2 ou MT-3 interagem e afectam o metabolismo do Aβ tornando-se, por isso, proteínas bastante promissoras para a investigação nesta área. Nesta perspectiva, estudos futuros que envolvam indução de stress/administração de glucocorticóides em modelos animais de AD cruzados com TTR knockout (KO) e/ou MT-1/2 e/ou MT-3 KO, com determinação dos níveis de Aβ no cérebro e análise do desempenho cognitivo, serão cruciais para a clarificação do papel destas moléculas no metabolismo do Aβ e na apoptose e, consequentemente, na progressão de certas doenças neurodegenerativas, como a AD.
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Plexus coroideu Transtiretina Péptido beta-amilóide Metalotioneínas Glucocorticóides Regulação neuroprotectora
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Universidade da Beira Interior