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Biosynthesis of small noncoding RNAs in Rhodovulum sulfidophilum
| datacite.subject.fos | CiĂȘncias MĂ©dicas::CiĂȘncias BiomĂ©dicas | por |
| dc.contributor.advisor | Passarinha, LuĂs AntĂłnio Paulino | |
| dc.contributor.advisor | Sousa, Fani Pereira de | |
| dc.contributor.author | Dias, Jane Risete Pires dos Santos | |
| dc.date.accessioned | 2020-03-09T16:56:25Z | |
| dc.date.available | 2020-03-09T16:56:25Z | |
| dc.date.issued | 2018-11-2 | |
| dc.date.submitted | 2018-10-8 | |
| dc.description.abstract | Biosynthesis of noncoding RNAs (ncRNAs) in microorganisms has stood out as a cost-effective and favourable method for natural RNA production, and Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum), a marine phototrophic bacterium, has been studied as a potential host for this bioprocess. Then, this work intends to optimize, in a mini bioreactor platform, the fermentation process of R. sulfidophilum strain DSM 1374 as a recombinant host to produce ncRNAs. So, the effect of the inoculum size, temperature and oxygen availability was studied, and the best outcome was achieved in fermentations at 30 ÂșC with 18% inoculum where fully aerobic-dark conditions are provided. Under such conditions the effects of the main carbon source were analysed in which glucose (Si = 10 g/L) was replaced by glycerol in R. sulfidophilum fermentation. Glycerol metabolization was analysed when using differents initial concentrations (Si = 20, 10, 5, and 2.5 g/L) and the consumption of both the carbon sources was assessed by HPLC-RID. Briefly, the optimized conditions in bioreactor scale yielded 1.8 times more biomass when glycerol (Si = 10 g/L) was the main carbon source, and 2.3 times more biomass compared to the optimized conditions in shake flask scale. Both carbon source lead to a maximum of total RNA production at 60 h, being of 537 ± 49 ”g/mL in glucose and 446 ± 58 ”g/mL in glycerol. Noteworthy, the electrophoretic qualitative analysis of small ncRNAs biosynthesis demonstrated a higher concentration also at 60 h in both glucose and glycerol fermentation. The results from the batch fermentations suggest a more efficient utilization of glycerol by R. sulfidophilum which reflects in higher biomass and reasonably higher ncRNA productivity. With a view of increasing the overall biomass and productivity, fed-batch experiments were carried out through constant glycerol feed. The results proved that a feed solution containing only glycerol does not lead to biomass increasing, as is expected, highlighting the interaction of different growth limiting factors. All these results together leave an open door for the study of glycerol as a substrate for recombinant biosynthesis of ncRNAs in R. sulfidophilum, specifically for the development of new feed strategies adequate to the nutritional requirements of the bacteria and that allow increasing the biomass and the productivity of ncRNAs. | eng |
| dc.description.abstract | Durante um longo perĂodo de tempo, a contribuição dos ĂĄcidos ribonucleicos (RNAs) nas funçÔes celulares foram amplamente subvalorizadas, limitando-se a serem descritos como intermediĂĄrios no processo celular em que uma sequĂȘncia de ĂĄcido desoxirribonucleico (DNA) codifica uma proteĂna. A investigação em torno destas molĂ©culas, contudo, permitiu identificar pequenas molĂ©culas de RNA nĂŁo codificantes (ncRNA) que participam em funçÔes celulares regulatĂłrias. Em muitos casos, a expressĂŁo diferencial destes RNAs Ă© reconhecida como hallmark de muitas patologias humanas incluindo vĂĄrios cancros, as doenças neurodegenerativas, as doenças cardiovasculares e a diabetes. Assim, assumem-se como potenciais biomarcadores para diagnĂłstico e prognĂłstico, mas tambĂ©m como novos alvos e agentes terapĂȘuticos. O uso de RNAs para fins clĂnicos tem exigido Ă comunidade cientĂfica uma investigação centrada nestas molĂ©culas por forma a decifrar corretamente a sua estrutura, função e interaçÔes. Assim, a necessidade de aceder a grandes quantidades de RNA aumentou e levou Ă procura de novos mĂ©todos para a produção de RNA. A combinação da tecnologia de DNA recombinante e de processos de fermentação de microrganismos, jĂĄ amplamente utilizada para a produção recombinante de proteĂnas, tem-se mostrado adequada para a biossĂntese de RNA em quantidades que, dificilmente, seriam obtidas por outras metodologias de forma sustentĂĄvel. Um dos principais objetivos deste mĂ©todo Ă© desenvolver estratĂ©gias para expressar o produto alvo de forma mais eficiente, ou seja, maior produtividade a menor custo. Para tal, a indĂșstria biotecnolĂłgica tem apostado em fermentaçÔes de elevada densidade celular cujo sucesso assenta na otimização do bioprocesso. InĂșmeros fatores devem ser considerados incluindo o organismo hospedeiro, as condiçÔes de fermentação, mas tambĂ©m as estratĂ©gias para maximizar seu crescimento e produção. A Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum), bactĂ©ria marinha fototrĂłfica facultativa, tem-se mostrado um potencial hospedeiro para a biossĂntese recombinante de pequenos RNAs regulatĂłrios, em parte, graças ao baixo nĂvel, intracelular e extracelular, de RNAses que permitem manter a integridade dos RNAs recombinantes. Ao longo dos anos, poucos estudos tĂȘm sido levados a cabo com o propĂłsito de maximizar o crescimento deste hospedeiro, deixando-a pouco apelativa para a indĂșstria biotecnolĂłgica quando comparada com a Escherichia coli, cujas estratĂ©gias de crescimento jĂĄ se encontram claramente definidas. Assim o objetivo da dissertação apresentada, centra-se em aumentar a densidade celular das fermentaçÔes de R. sulfidophilum e consequentemente incrementar a produtividade de ncRNAs. Para tal, foram realizadas fermentaçÔes batch em mini-bioreatores, nas quais o efeito do tamanho do inĂłculo, da disponibilidade de oxigĂ©nio e da temperatura foram estudadas, tendo como referĂȘncia valores aplicados em fermentaçÔes em erlenmeyers. AlĂ©m disso, tendo em consideração o impacto que a fonte de carbono pode ter na formação de biomassa, a glucose e o glicerol foram comparados em diferentes outputs deste bioprocesso. Relativamente ao inĂłculo, foram testados quatro tamanhos diferentes (13%, 18%, 24% e 30%) o que permitiu estabelecer 18% como o tamanho de inĂłculo mais adequado Ă s fermentaçÔes em bioreator devido aos maiores nĂveis de biomassa alcançados. Foram, igualmente, testadas temperaturas diferentes para as fermentaçÔes, 25, 30 e 37 ÂșC, e avaliada a sua influĂȘncia no perfil de crescimento. A temperatura que favoreceu a obtenção de nĂveis de biomassa mais elevados foi a de 30 ÂșC sendo, por isso, selecionada como temperatura Ăłtima para as fermentaçÔes de R. sulfidophilum em bioreator. A glucose (10 g/L) e o glicerol (20, 10, 5 e 2,5 g/L) foram testados como fonte principal de carbono nas fermentaçÔes em bioreator e suas concentraçÔes no meio extracelular foram quantificadas ao longo do tempo por HPLC acoplado com um detetor por Ăndice de refração. Ambas as fontes de carbono, apresentaram um perfil de consumo semelhante, onde começaram a ser efetivamente metabolizados pela bactĂ©ria apĂłs 40 h de fermentação. Contudo a utilização de glicerol como principal fonte de carbono resultou num aumento considerĂĄvel de biomassa final (5,94 g/L) quando comparado com a glucose (3,30 g/L). Em termos do produto alvo, foi estudada quantitativamente a produção de RNA total e qualitativamente a produção de ncRNAs. A produção de RNA total, em amostras normalizadas pela massa de cĂ©lulas obtida, foi analisada ao longo do tempo, evidenciando-se, para ambas, um pico de produção Ă s 60 horas de fermentação correspondendo a 537 ± 49 ”g/mL para a glucose e 446 ± 58 ”g/mL para o glicerol. Paralelamente, a anĂĄlise qualitativa da expressĂŁo de ncRNAs demostrou um pico de produção Ă s 60 h para as duas fontes de carbono, sugerindo que a produção recombinante de RNA em R. sulfidophilum acompanha o perfil de produção de RNAs homĂłlogos. Considerando todos os resultados obtidos, Ă© possĂvel concluir que a substituição da glucose por glicerol para a produção recombinante de ncRNAs em R. sulfidophilum em fermentaçÔes batch Ă temperatura de 30 ÂșC e com 18 % de inĂłculo Ă© promissora, uma vez que resultou numa maior produção volumĂ©trica graças ao simples incremento da biomassa. Os resultados em batch deixam uma porta aberta para o estudo de novas estratĂ©gias de fermentaçÔes (fed-batch) e para otimização das fermentaçÔes recorrendo a design experimental no qual os ensaios sĂŁo planeados estrategicamente analisando o efeito sinergĂ©tico de inputs alvos, para se obter maior informação sobre o efeito de mais do que um parĂąmetro na produtividade do biotarget. | por |
| dc.identifier.tid | 202354130 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/9863 | |
| dc.language.iso | eng | por |
| dc.subject | Mini-Bioreactors | por |
| dc.subject | Noncoding Rnas | por |
| dc.subject | Recombinant Biosynthesis | por |
| dc.subject | Rhodovulum Sulfidophilum | por |
| dc.title | Biosynthesis of small noncoding RNAs in Rhodovulum sulfidophilum | por |
| dc.title.alternative | Optimization of the fermentation process | por |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| person.familyName | Pires dos Santos Dias | |
| person.givenName | Jane Risete | |
| person.identifier.ciencia-id | 9711-2291-CC80 | |
| person.identifier.orcid | 0000-0002-1721-6073 | |
| rcaap.rights | openAccess | por |
| rcaap.type | masterThesis | por |
| relation.isAuthorOfPublication | d69a1528-1f39-4f66-bdee-57df9f31e9bf | |
| relation.isAuthorOfPublication.latestForDiscovery | d69a1528-1f39-4f66-bdee-57df9f31e9bf | |
| thesis.degree.name | 2Âș Ciclo em CiĂȘncias BiomĂ©dicas | por |
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