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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Since its discovery in 1991, the Aliarcobacter genus comprises 11 recognized species,
including Aliarcobacter butzleri. This species has been described as a pathogen, being
the fourth Campylobacter-related microorganism most commonly found in human
diarrheic samples. Infections by this bacterium are often associated with abdominal
cramps, nausea and watery diarrhoea. Although some studies described its pathogenic
potential, still not much is known about its virulence mechanisms, which can
complicate the treatment of infections caused by this microorganism and its control. In
this manner, this work aimed to evaluate the different virulence phenotypic profiles of
fifteen human isolates of A. butzleri. Initially, all isolates were typed by Multilocus
Sequence Typing, which showed that all isolates belonged to different sequence types,
pointing towards the genetic diversity of this bacterium. Next, several assays were
performed to characterize the virulence phenotypic profile of each clinical isolate by
assessing: (i) the antimicrobial profile through determination of the minimum
inhibitory concentration (MIC) of six antibiotics of distinct classes; (ii) the
susceptibility to reactive oxygen and nitrogen species; (iii) survival in acidic conditions
(pH 4); (iv) the presence of the urease enzyme; (v) the resistance to bile salts; (vi) the
chemotactic profile of each strain; (vii) the motility; (viii) differences in morphotype;
(ix) biofilm formation ability; (x) haemolytic activity; (xi) survival in human serum; and
(xii) the interaction between A. butzleri with the human colorectal adenocarcinoma cell
line, Caco-2. Although, the clinical A. butzleri isolates under study, showed similar
oxidative and nitrosative stress responses and morphotype, it was observed a great
phenotypic variety among the isolates. Various isolates showed a multidrug resistance
profile, with higher resistance frequency being observed for the antibiotics: ertapenem
(100%), tetracycline (93.3%), and ampicillin (86.6%). Considering the potential
survival of the isolates through the gastrointestinal system, the isolates demonstrated
diverse resistance profiles against acidic conditions, with six strains having a positive
phenotype for the presence of the urease enzyme, but all demonstrated to be resistant
do the bile salts concentrations found in the human gut. Distinct chemotactic profiles
indicating a possible interaction with compound of the human mucosa were observed.
The isolates under study demonstrated low motility or a diverse profile of higher
motility, and different profiles of biofilm formation classified from weak to strong
biofilm formers. The A. butzleri isolates showed weak haemolytic activity and low
survival in the human serum, with exception of one. Only seven strains demonstrated
to be capable of invading Caco-2 cells, while all showed to be adherent to the cell line
despite at different levels. The effect of aerobic conditions in the phenotype has also been studied on three isolates
presenting distinct phenotypic profiles (INSA Cu 29393, INSA 3202 e INSA 3711). To
evaluate the differences in the phenotypic profile when subjected to different
atmospheric conditions (aerobiosis and microaerophilia), a similar characterization to
the one done for assessment of the phenotypic profile of the clinical isolates was
performed. Overall, the aerobic conditions seemed to have a positive effect in the
haemolytic activity and motility of the isolates, although having no impact on the
flagellin A expression. Further, the aerobic conditions also negatively affected the
oxidative stress resistance of the isolates, with the remaining assays showing a strainspecific response.
In conclusion, taking into account the results obtained, we can acknowledge that a
great phenotypic variability can be found among the clinical isolates of A. butzleri
studied, which may be associated with a different host-bacterium interaction.
Desde a sua descoberta em 1991 até aos dias de hoje, o género Aliarcobacter compreende cerca de 11 espécies reconhecidas, incluindo Aliarcobacter butzleri. Esta espécie é descrita como um enteropatogéneo emergente, sendo o quarto organismo relacionado com Campylobacter mais frequentemente encontrado em fezes diarreicas no ser humano. Infeções por esta espécie são ainda associadas a dores abdominais, náuseas e diarreia aquosa. Devido não só à sintomatologia associada a esta bactéria, mas também à sua grande prevalência na cadeia alimentar, esta espécie foi desde 2002 incluída na lista de microrganismos considerados um sério risco para a saúde humana pela Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos. Apesar de alguns estudos descreverem o potencial patogénico de A. butzleri, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos virulência deste patógeno, o que pode dificultar o tratamento de infeções causadas pelo mesmo e o seu controlo. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar os diferentes perfis fenotípicos de virulência de quinze isolados de A. butzleri com origem em fezes humanas. Inicialmente, os isolados foram distinguidos usando tipagem por sequenciação de múltiplos loci (MLST, do inglês Multilocus Sequence Typing), verificando-se que todos os isolados pertenciam a diferentes sequência-tipo (ST), caracterizando-se então por serem geneticamente distintos. Os resultados também apontaram para a alta variabilidade genética que já tem sido descrita nesta bactéria. Em seguida, vários ensaios foram realizados de modo a caracterizar o perfil de fenotípico de virulência de cada isolado clínico. O perfil de resistência a antimicrobianos tem sido considerado como um elementochave na caracterização de agentes patogénicos, possibilitando o uso de um tratamento correto face a uma infeção bacteriana. Neste trabalho, o perfil de resistência para as estirpes em estudo foi realizado através da determinação das concentrações mínima inibitórias de seis antibióticos pertencentes a diferentes classes (ampicilina, ciprofloxacina, tetraciclina, eritromicina, gentamicina e ertapenemo). Esta determinação foi realizada através de difusão em agar com exceção do ertapnemo que foi realizado usando um ensaio de difusão em disco. Os isolados apresentaram seis perfis distintos de resistência, com frequências de resistência superiores para o ertapenemo (100%), a tetraciclina (93,3%) e a ampicilina (86,6%), sendo que a maioria dos isolados apresentou um perfil de multirresistência. Espécies reativas de oxigénio bem como espécies reativas de azoto estão presentes no meio ambiente, mas são também usadas pelo sistema imunitário do hospedeiro de modo a proteger-se contra infeções bacterianas. De modo a avaliar a resposta dos isolados clínicos de A. butzleri, o perfil de resistência aos stresses oxidativo e nitrosativo foi avaliado usando ensaios de difusão em disco, contendo peróxido de hidrogénio, metil de viologénio ou nitroprussiato de sódio. Os isolados clínicos analisados, apresentaram perfis de resistência semelhantes com pequenas variações de suscetibilidade na presença de metil de viologénio e peróxido de hidrogénio a 3% (stress oxidativo), enquanto nenhuma dos estipes se demonstrou sensível à presença do nitroprussiato de sódio (stress nitrosativo). De seguida de modo a tentar perceber como é que A. butzleri é capaz de chegar ao intestino para causar infeção, avaliou-se um conjunto de fatores que estão potencialmente associados com a sobrevivência no trato gastrointestinal. Assim, a sobrevivência em ambiente acídico foi estudada por incubação de cada isolado durante uma hora a pH 4; avaliou-se a presença da enzima urease através da avaliação da sua atividade usando meio contendo ureia, e a resistência a sais biliares por determinação da sua concentração mínima inibitória. Em relação à sobrevivência em pH 4, pôde-se verificar que cinco dos isolados se demonstraram mais sensíveis ao pH ácido, enquanto as restantes apresentaram diferentes níveis de resistência. Também foi verificada a presença de fenótipo positivo para a presença da urease em seis estirpes de A. butzleri, embora não tenha sido correlacionado com a resistência ao ácido. Em relação à resistência aos sais biliares, todas as estirpes demonstraram ser resistentes às concentrações descritas para o intestino humano. Para avaliar a quimiotaxia relacionada com as estirpes, a caracterização do perfil quimiotático dos isolados foi analisada usando nove compostos diferentes representando compostos tais como: hidratos de carbono, aminoácidos e ácidos orgânicos. Todos os isolados apresentaram distintos perfis quimiotáticos, sugerindo uma possível quimioatração por componentes da mucosa intestinal. Considerando que a motilidade confere uma vantagem no processo de infeção, a motilidade foi também avaliada nos isolados clínicos de A. butzleri. Esta característica foi então determinada por inoculação em placas de meio com 0,4 % (m/v) de agar, seguido de incubação durante 48 h e posterior medição do halo. Os isolados apresentaram dois perfis distintos, um em que seis isolados apresentaram baixa motilidade e outro grupo mais heterogéneo com valores moderados e altos de motilidade. Para observar possíveis diferenças no morfótipo e produção celulose de cada isolado, a morfologia das colónias de cada estirpe foi observada em placas suplementadas Congo red e azul brilhante de Coomassie, bem como em placas suplementadas com Calcoflour white, respetivamente. Após análise, todos os isolados parecem apresentar o morfótipo Bdar (do inglês: “brown, dry and rough”), sugerindo a potencial presença de fimbrias e a ausência de produção de celulose. A capacidade de formação de biofilmes também tem sido descrita como um importante fator na sobrevivência tanto no ambiente como no hospedeiro, sendo capaz de aumentar a resistência ao sistema imunitário e à presença de antibióticos. Para avaliar a capacidade de formação de biofilmes foi usada a metodologia de coloração com violeta de cristal usando placas de 24 poços. Na sua maioria, os isolados apresentaram moderada a alta capacidade de formação de biofilme. A presença de hemolisinas tem sido reportada em A. butzleri, as quais podem conferir às estirpes capacidade hemolítica, sendo capazes de induzir lise de eritrócitos. Para verificar a atividade hemolítica, os isolados foram incubados com eritrócitos humanos. Todos os isolados demonstraram uma capacidade hemolítica fraca, no entanto verificou-se a existência de dois isolados com perfil distinto apresentando valores de capacidade hemolítica superiores. Em A. butzleri foi já sugerido um papel do soro humano na sua natureza limitante durante a infeção, sendo assim relevante perceber o comportamento desta bactéria em soro. A sobrevivência no soro humano foi realizada pela incubação com os isolados durante um período de uma hora, onde maior parte dos isolados se apresentaram como sensíveis ao soro humano após 20 minutos de incubação. Por fim, de modo a estudar a interação bacteriana com a linha de células de adenocarcinoma colorretal humano, Caco-2 (capacidade de adesão e invasão), a linha celular foi infetada com cada isolado clínico de A. butzleri com uma multiplicidade de infeção de 200. Todas as estirpes demonstraram ser capazes de aderir a esta linha celular, mas apenas sete isolados apresentaram capacidade de invasão celular. A. butzleri tem sido descrito como aerotolerante, no entanto exposição a elevados níveis de oxigénio pode ser capaz de induzir stress. Para avaliar os efeitos da exposição a condições de aerobiose, três isolados com perfis fenotípicos diferentes (INSA Cu 29393, INSA 3202 e INSA 3711) foram selecionados para mais estudos. Para avaliar as possíveis diferenças de perfil fenotípico dos isolados de A. butzleri quando sujeitos a diferentes condições atmosféricas (aerobiose e microaerobiose) foram realizados ensaios de avaliação da resistência aos stresses oxidativo e nitrosativo, sobrevivência em meio ácido, sobrevivência em soro humano, motilidade, capacidade de formação de biofilme, capacidade hemolítica e capacidade de adesão e invasão em linhas celulares Caco-2. De forma geral, as condições aeróbicas parecem favorecer a capacidade hemolítica e a motilidade dos isolados, apesar de não modificarem a expressão relativa da flagelina A. Para além disso, quando em aerobiose parece ocorrer um desfavorecimento da resistência ao stress oxidativo, e não se observa impacto na invasão a células do hospedeiro. Nos restantes ensaios foram obtidos resultados variáveis dependentes do isolado em estudo. Em suma, tendo em conta os resultados obtidos, podemos afirmar que existe uma grande variabilidade fenotípica entre os isolados clínicos de A. butzleri estudados, e que muitos dos mecanismos associados às suas características associadas a virulência continuam por explorar.
Desde a sua descoberta em 1991 até aos dias de hoje, o género Aliarcobacter compreende cerca de 11 espécies reconhecidas, incluindo Aliarcobacter butzleri. Esta espécie é descrita como um enteropatogéneo emergente, sendo o quarto organismo relacionado com Campylobacter mais frequentemente encontrado em fezes diarreicas no ser humano. Infeções por esta espécie são ainda associadas a dores abdominais, náuseas e diarreia aquosa. Devido não só à sintomatologia associada a esta bactéria, mas também à sua grande prevalência na cadeia alimentar, esta espécie foi desde 2002 incluída na lista de microrganismos considerados um sério risco para a saúde humana pela Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos. Apesar de alguns estudos descreverem o potencial patogénico de A. butzleri, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos virulência deste patógeno, o que pode dificultar o tratamento de infeções causadas pelo mesmo e o seu controlo. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar os diferentes perfis fenotípicos de virulência de quinze isolados de A. butzleri com origem em fezes humanas. Inicialmente, os isolados foram distinguidos usando tipagem por sequenciação de múltiplos loci (MLST, do inglês Multilocus Sequence Typing), verificando-se que todos os isolados pertenciam a diferentes sequência-tipo (ST), caracterizando-se então por serem geneticamente distintos. Os resultados também apontaram para a alta variabilidade genética que já tem sido descrita nesta bactéria. Em seguida, vários ensaios foram realizados de modo a caracterizar o perfil de fenotípico de virulência de cada isolado clínico. O perfil de resistência a antimicrobianos tem sido considerado como um elementochave na caracterização de agentes patogénicos, possibilitando o uso de um tratamento correto face a uma infeção bacteriana. Neste trabalho, o perfil de resistência para as estirpes em estudo foi realizado através da determinação das concentrações mínima inibitórias de seis antibióticos pertencentes a diferentes classes (ampicilina, ciprofloxacina, tetraciclina, eritromicina, gentamicina e ertapenemo). Esta determinação foi realizada através de difusão em agar com exceção do ertapnemo que foi realizado usando um ensaio de difusão em disco. Os isolados apresentaram seis perfis distintos de resistência, com frequências de resistência superiores para o ertapenemo (100%), a tetraciclina (93,3%) e a ampicilina (86,6%), sendo que a maioria dos isolados apresentou um perfil de multirresistência. Espécies reativas de oxigénio bem como espécies reativas de azoto estão presentes no meio ambiente, mas são também usadas pelo sistema imunitário do hospedeiro de modo a proteger-se contra infeções bacterianas. De modo a avaliar a resposta dos isolados clínicos de A. butzleri, o perfil de resistência aos stresses oxidativo e nitrosativo foi avaliado usando ensaios de difusão em disco, contendo peróxido de hidrogénio, metil de viologénio ou nitroprussiato de sódio. Os isolados clínicos analisados, apresentaram perfis de resistência semelhantes com pequenas variações de suscetibilidade na presença de metil de viologénio e peróxido de hidrogénio a 3% (stress oxidativo), enquanto nenhuma dos estipes se demonstrou sensível à presença do nitroprussiato de sódio (stress nitrosativo). De seguida de modo a tentar perceber como é que A. butzleri é capaz de chegar ao intestino para causar infeção, avaliou-se um conjunto de fatores que estão potencialmente associados com a sobrevivência no trato gastrointestinal. Assim, a sobrevivência em ambiente acídico foi estudada por incubação de cada isolado durante uma hora a pH 4; avaliou-se a presença da enzima urease através da avaliação da sua atividade usando meio contendo ureia, e a resistência a sais biliares por determinação da sua concentração mínima inibitória. Em relação à sobrevivência em pH 4, pôde-se verificar que cinco dos isolados se demonstraram mais sensíveis ao pH ácido, enquanto as restantes apresentaram diferentes níveis de resistência. Também foi verificada a presença de fenótipo positivo para a presença da urease em seis estirpes de A. butzleri, embora não tenha sido correlacionado com a resistência ao ácido. Em relação à resistência aos sais biliares, todas as estirpes demonstraram ser resistentes às concentrações descritas para o intestino humano. Para avaliar a quimiotaxia relacionada com as estirpes, a caracterização do perfil quimiotático dos isolados foi analisada usando nove compostos diferentes representando compostos tais como: hidratos de carbono, aminoácidos e ácidos orgânicos. Todos os isolados apresentaram distintos perfis quimiotáticos, sugerindo uma possível quimioatração por componentes da mucosa intestinal. Considerando que a motilidade confere uma vantagem no processo de infeção, a motilidade foi também avaliada nos isolados clínicos de A. butzleri. Esta característica foi então determinada por inoculação em placas de meio com 0,4 % (m/v) de agar, seguido de incubação durante 48 h e posterior medição do halo. Os isolados apresentaram dois perfis distintos, um em que seis isolados apresentaram baixa motilidade e outro grupo mais heterogéneo com valores moderados e altos de motilidade. Para observar possíveis diferenças no morfótipo e produção celulose de cada isolado, a morfologia das colónias de cada estirpe foi observada em placas suplementadas Congo red e azul brilhante de Coomassie, bem como em placas suplementadas com Calcoflour white, respetivamente. Após análise, todos os isolados parecem apresentar o morfótipo Bdar (do inglês: “brown, dry and rough”), sugerindo a potencial presença de fimbrias e a ausência de produção de celulose. A capacidade de formação de biofilmes também tem sido descrita como um importante fator na sobrevivência tanto no ambiente como no hospedeiro, sendo capaz de aumentar a resistência ao sistema imunitário e à presença de antibióticos. Para avaliar a capacidade de formação de biofilmes foi usada a metodologia de coloração com violeta de cristal usando placas de 24 poços. Na sua maioria, os isolados apresentaram moderada a alta capacidade de formação de biofilme. A presença de hemolisinas tem sido reportada em A. butzleri, as quais podem conferir às estirpes capacidade hemolítica, sendo capazes de induzir lise de eritrócitos. Para verificar a atividade hemolítica, os isolados foram incubados com eritrócitos humanos. Todos os isolados demonstraram uma capacidade hemolítica fraca, no entanto verificou-se a existência de dois isolados com perfil distinto apresentando valores de capacidade hemolítica superiores. Em A. butzleri foi já sugerido um papel do soro humano na sua natureza limitante durante a infeção, sendo assim relevante perceber o comportamento desta bactéria em soro. A sobrevivência no soro humano foi realizada pela incubação com os isolados durante um período de uma hora, onde maior parte dos isolados se apresentaram como sensíveis ao soro humano após 20 minutos de incubação. Por fim, de modo a estudar a interação bacteriana com a linha de células de adenocarcinoma colorretal humano, Caco-2 (capacidade de adesão e invasão), a linha celular foi infetada com cada isolado clínico de A. butzleri com uma multiplicidade de infeção de 200. Todas as estirpes demonstraram ser capazes de aderir a esta linha celular, mas apenas sete isolados apresentaram capacidade de invasão celular. A. butzleri tem sido descrito como aerotolerante, no entanto exposição a elevados níveis de oxigénio pode ser capaz de induzir stress. Para avaliar os efeitos da exposição a condições de aerobiose, três isolados com perfis fenotípicos diferentes (INSA Cu 29393, INSA 3202 e INSA 3711) foram selecionados para mais estudos. Para avaliar as possíveis diferenças de perfil fenotípico dos isolados de A. butzleri quando sujeitos a diferentes condições atmosféricas (aerobiose e microaerobiose) foram realizados ensaios de avaliação da resistência aos stresses oxidativo e nitrosativo, sobrevivência em meio ácido, sobrevivência em soro humano, motilidade, capacidade de formação de biofilme, capacidade hemolítica e capacidade de adesão e invasão em linhas celulares Caco-2. De forma geral, as condições aeróbicas parecem favorecer a capacidade hemolítica e a motilidade dos isolados, apesar de não modificarem a expressão relativa da flagelina A. Para além disso, quando em aerobiose parece ocorrer um desfavorecimento da resistência ao stress oxidativo, e não se observa impacto na invasão a células do hospedeiro. Nos restantes ensaios foram obtidos resultados variáveis dependentes do isolado em estudo. Em suma, tendo em conta os resultados obtidos, podemos afirmar que existe uma grande variabilidade fenotípica entre os isolados clínicos de A. butzleri estudados, e que muitos dos mecanismos associados às suas características associadas a virulência continuam por explorar.
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