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Uso de gelana como uma nova abordagem na purificação de biomoléculas
| dc.contributor.advisor | Passarinha, Luís António Paulino | |
| dc.contributor.author | Rocha, Luís António Ferreira | |
| dc.date.accessioned | 2015-04-13T18:09:04Z | |
| dc.date.available | 2015-04-13T18:09:04Z | |
| dc.date.issued | 2012 | |
| dc.date.submitted | 2012-10 | |
| dc.description.abstract | O desenvolvimento de novas estratégias de purificação de biomoléculas terapêuticas tem ganho uma elevada importância nos últimos anos. Por isso, e de forma inovadora, pretende-se com esta dissertação desenvolver uma nova matriz cromatográfica baseada no polímero polissacárido gelana. Esta nova abordagem cromatográfica tem em conta propriedades como a porosidade e hidrofilicidade dos géis de gelana. Pretendeu-se explorar a natureza aniónica natural deste polímero, bem como a carga dos contra-iões da sua formulação para o estabelecimento de interacções com três proteínas modelo (lisozima, albumina bovina sérica e α-quimiotripsina). Para avaliar a potencial aplicação da gelana como fase estacionária foram efectuados ensaios de estabilidade com diferentes contra-iões, bem como de aferição da sua estrutura, procendo-se por fim ao estudo dos comportamentos de ligação das três proteínas modelo em passos cromatográficos. Dos três iões estudados (cobre, níquel e cálcio), o que conferiu maior estabilidade à matriz foi o cobre, constatando-se uma dependência da presença dos outros dois iões (cálcio e níquel) no ambiente químico de cada uma das suas formulações. Para se melhor compreender a estrutura dos géis de gelana usou-se a técnica de microscopia electrónica de varrimento. As imagens obtidas revelam que o protocolo desenvolvido não foi aplicado com sucesso, tendo havido um comprometimento estrutural da matriz, por uma má desidratação ou por desadequamento do protocolo usado. Finalmente aplicaram-se duas formulações, com dois iões diferentes (cálcio e cobre) em ensaios cromatográficos, estabelecendo-se diferentes comportamentos entre a matriz e as proteínas consoante o ião utilizado na formulação. Nos ensaios dos géis com cálcio a única biomolécula que ficou retida na matriz foi a lisozima, eluindo as outras duas proteínas em estudo nas primeiras fracções recolhidas. Desta forma, foi também possível nestas condições a separação de misturas simples de lisozima e α-quimiotripsina e de lisozima e albumina bovina sérica. Os ensaios cromatográficos com cobre como contra-ião da matriz de gelana verificaram uma retenção de todas as proteínas estudadas, através de diferentes interacções. A lisozima e a α-quimiotripsina, pela carga apresentada nos ensaios, interagiram com a gelana, ao passo que, a albumina bovina sérica interagiu com o cobre presente na matriz. Estes resultados preliminares carecem de confirmação por técnicas complementares, mas a interacção das proteínas em estudo com a matriz é visível pelos cromatogramas obtidos. Em conclusão, esta dissertação permitiu pela primeira vez a aplicação da gelana como matriz cromatográfica, conseguindo-se a retenção de diferentes proteínas, por diferentes tipos de interacção. | por |
| dc.description.abstract | The development of new therapeutic biomolecules purification strategies has gained an increased relevance in the last years. In that way, it is pretended to develop a new chromatographic matrix based in the polysaccharide polymer gellan. This new chromatographic approach takes in account properties like the porosity and hydrophilicity of gellan gels. It is intended to explore the natural anionic nature of this polymer as well as the charge of the counter-ion present in the formulation of these gels in order to establish different interactions with three model proteins (lysozyme, bovine serum albumin and αchymotrypsin). To assess the potential of this new application stability assays in the presence of different counter-ions, as well as to gauge the structure of gellan, studying at last the interaction behavior of these three proteins in chromatographic steps. Of the three studied ions (copper, nickel and calcium) it was copper who gave the biggest stability to the matrix, being noted that the formulations that used the other two ions were dependent of their presence in the chemical environment. To best understand the structure of these gels it was used scanning electron microscopy. The obtained images revealed that the protocol was unsuccessfully applied, being noted a structural damage of the matrix, either by its bad dehydration or by the inadequacy of the used protocol. Finally, two formulations with two different ions (calcium and copper) where applied in Chromatographic assays, being established different behaviors between the matrix and the proteins, according to the formulation ions. In the calcium assays the only retained biomolecule was lysozyme. In contrast, the other two proteins where eluted in the flowthrough fractions. These conditions also made possible to separate simple mixtures of lysozyme- α-chymotrypsin and lysozyme-bovine serum albumin. When the gellan with copper matrix was used it was verified the retention of all the studied proteins. Lysozyme and αchymotrypsin, by the charge presented, interacted with gellan and bovine serum albumin with the copper of the matrix. These preliminary results lack of confirmation by complementary techniques, but the interaction with the matrix is visible in the obtained chromatograms. In conclusion, this dissertation allowed the first application of gellan as a chromatographic matrix, with the retention of different proteins, by different kinds of interactions, in this new chromatographic stationary phase. | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/3257 | |
| dc.language.iso | por | por |
| dc.subject | Cromatografia - Troca iónica | por |
| dc.subject | Gelana - Matriz | por |
| dc.subject | Gelana - Purificação de biomoléculas | por |
| dc.subject | Proteínas | por |
| dc.title | Uso de gelana como uma nova abordagem na purificação de biomoléculas | por |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | openAccess | por |
| rcaap.type | masterThesis | por |
| thesis.degree.discipline | Bioquímica | por |
| thesis.degree.level | Mestre | por |
| thesis.degree.name | Dissertação apresentada à Universidade da Beira Interior para a obtenção do grau de Mestre em Bioquímica | por |
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