Estudo dos défices da via de biossíntese do colesterol: implementação de uma metodologia e determinação de valores de referência de esteróis em amostras de líquido amniótico

Amaral, Cristina Isabel Borges Dias

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Estudo dos défices da via de biossíntese do colesterol: implementação de uma metodologia e determinação de valores de referência de esteróis em amostras de líquido amniótico

2008Master thesis

dc.contributor.advisor	Cardoso, Maria Luís
dc.contributor.advisor	Tomaz, Cândida Ascensão Teixeira
dc.contributor.author	Amaral, Cristina Isabel Borges Dias
dc.date.accessioned	2014-10-27T10:02:39Z
dc.date.available	2014-10-27T10:02:39Z
dc.date.issued	2008
dc.date.submitted	2008
dc.description.abstract	A síndrome Smith-Lemli-Optiz (SLO) (MIM 270400) é uma doença autossómica recessiva, de natureza metabólica, caracterizada por um padrão de dismorfias faciais minor, alterações dos membros e malformações congénitas múltiplas. Foi pela primeira vez descrita por Smith e colaboradores em 1964, e em 1993 foi considerada um erro hereditário da biossíntese de colesterol. É provocada por um defeito na enzima 7-dehidrocolesterol reductase(DHCR7) (E.C. 1.3.1.21), responsável pelo último passo da via de biossíntese de colesterol. A enzima DHCR7 é codificada pelo gene DHCR7. As mutações no gene DHCR7 provocam SLO. A síndrome SLO caracteriza-se por hipocolesterolemia e níveis elevados de 7-dehidrocolesterol (7-DHC) no sangue e nos tecidos. A prevalência estimada de SLO varia entre 1/20.000 a 1/70.000 nados-vivos na população Caucasiana. O colesterol e os precursores de colesterol (7-dehidrocolesterol (7-DHC), desmosterol e latosterol) são importantes marcadores bioquímicos da biossíntese de colesterol e a sua quantificação é útil para o diagnóstico de doenças da via de biossíntese de colesterol, em especial a síndrome SLO. Têm sido descritos na literatura vários métodos para a quantificação de esteróis. Entre eles o mais comum é a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS), operando num modo de ião selectivo (SIM). O objectivo principal deste trabalho foi desenvolver um método analítico de cromatografia – cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS), que permita a detecção, separação e quantificação de diversos esteróis em fluídos e tecidos biológicos. Uma vez que a metodologia de HPLC não permitiu a separação dos diversos esteróis numa mesma corrida cromatográfica, foi optimizado um método de GC-MS, que se mostrou linear e preciso, com múltiplas aplicações entre as quais permitir a quantificação dos diversos esteróis numa mesma corrida cromatográfica. O método de GC-MS baseia-se numa hidrólise alcalina dos ésteres de esteróis, extracção dos esteróis, derivatização e quantificação dos esteróis. O método é linear para o colesterol (R2 > 0.999), 7-DHC (R2 > 0.998), desmosterol (R2 > 0.999), latosterol (R2 > 0.999) e β-sitosterol (R2 > 0.999). Os coeficientes de variação intra-série e inter-série foram 1.8% e 2.9% para o colesterol, 0.5% e 1.6% para o 7-DHC, 2.3% e 4.3% para o desmosterol, 2.2% e 3.2% para o latosterol e 0.9% e 2.7% para o β-sitosterol, respectivamente. Foram aferidos valores de referência para os diversos esteróis em 330 amostras de líquidos amnióticos (LA) analisadas por GC-MS no modo SIM. As amostras foram agrupadas em função da idade gestacional – das 13 às mais de 22 semanas de gravidez. Os resultados demonstraram que com o avanço da gravidez, a concentração de colesterol no líquido amniótico aumenta, assim como os seus precursores e o β-sitosterol. Este facto está relacionado com a crescente necessidade de colesterol para o desenvolvimento fetal. Foi também analisada por GC-MS uma amostra de um feto com suspeita clínica de SLO, onde a concentração de colesterol era baixa e os níveis de 7-DHC, latosterol e β-sitosterol encontravam-se aumentados, quando comparado com os valores de referência. Tendo em conta os resultados e o quadro clínico e bioquímico da patologia, o feto foi diagnosticado bioquimicamente como portador da síndrome SLO. Este trabalho permitiu demonstrar que o intervalo dos valores de referência para cada esterol no LA, calculado para diferentes idades gestacionais (das 13 às mais de 22 semanas), é útil para a validação de resultados de um diagnóstico bioquímico pré-natal de erros inatos da via biossíntese de colesterol. Estes estudos foram efectuados na Unidade de Biologia Clínica do Centro de Genética Médica Dr. Jacinto de Magalhães – Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge e parcialmente suportados pelo projecto 101/2007 da Comissão de Fomento da Investigação em Cuidados de Saúde.	por
dc.description.abstract	The Smith-Lemli-Optiz syndrome (SLO) (MIM 270400) is an autosomal recessive metabolic disease, characterized by a pattern of facial dysmorphism, malformation of limbs and multiple congenital malformations. It was described by Smith and colleagues in 1964, and since 1993 it is known as an inherited error of metabolism of the cholesterol biosynthesis resulting from deficiency of the enzyme 7-dehydrocholesterol reductase (DHCR7) (E.C. 1.3.1.21), responsible for the last step of the cholesterol biosynthesis pathway. Mutations in the gene DHCR7, that encoding DHCR7, are responsible for SLO. The SLO syndrome is characterized by hypocholesterolemia and elevated serum concentration of 7- dehydrocholesterol (7-DHC) in blood and tissues. The birth prevalence of SLO is estimated to be approximately 1/20.000 to 1/70.000 live births in Caucasians. Cholesterol and cholesterol precursors (7-dehydrocholesterol (7-DHC), desmosterol and lathosterol) are important biochemical markers of cholesterol biosynthesis, and their quantification is useful for the diagnosis of disorders of cholesterol biosynthesis pathway, specially the SLO syndrome. Several methods were described in literature for sterols quantification. Among them gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) with selected-ion monitoring (SIM) is the most common one. The principal aim of our investigation was to develop an analytical chromatographic – high performance liquid chromatography (HPLC) method or gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) method, for sterols detection, separation and quantification in tissues and biological fluids. Since the HPLC method did not separate and quantify the sterols in a same chromatographic run, it was optimized a GC-MS method. The GC-MS method was based on the alkaline hydrolysis of sterol esters, extraction of free sterols, derivatization and quantification of sterols. The method was linear for cholesterol (R2 > 0.999), 7-DHC (R2 > 0.998), desmosterol (R2 > 0.999), lathosterol (R2 > 0.999) and β-sitosterol (R2 > 0.999). Within-run and between-run coefficients of variation were 1.8% and 2.9% for cholesterol, 0.5% and 1.6% for 7-DHC, 2.3% and 4.3% for desmosterol, 2.2% and 3.2% for lathosterol and 0.9% and 2.7% for β-sitosterol, respectively. The reference values were determined for the different sterols in 330 samples of amniotic fluids analysed by GC-MS with SIM. The samples were grouped by gestational age between 13 and more than 22 weeks of pregnancy. The results showed that as long as pregnancy goes on, the concentration of cholesterol in amniotic fluid increases, as well as its precursors and β-sitosterol. This fact is related with the increased need of cholesterol of the developing fetus. A sample of a fetus with clinical suspicion of SLO was also analysed by GC-MS. The concentration of cholesterol was decrease and the levels of 7-DHC, lathosterol and βsitosterol were elevated, when compared with reference values. The results can biochemical diagnoses the fetus as a carried fetus SLO. This work showed that the reference range of each sterol in amniotic fluid, calculated by different gestational age (13 to more than 22 weeks) is useful for validation of results of biochemical prenatal diagnosis of inborn errors of cholesterol biosynthesis other than SLO. These studies were carried out in the Clinical Biology Unit of Medical Genetics of Center Dr. Jacinto Magalhães – National Health Institute of Dr. Ricardo Jorge, and was partially supported by project 101/2007 from “Comissão de Fomento da Investigação em Cuidados de Saúde”.
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10400.6/2488
dc.language.iso	por	por
dc.subject	Síndrome Smith-Lamli-Opitz	por
dc.subject	Biossíntese de colesterol	por
dc.subject	Líquido amniótico	por
dc.subject	Latosterol	por
dc.subject	Diagnostico pré-natal	por
dc.subject	Desmosterol	por
dc.title	Estudo dos défices da via de biossíntese do colesterol: implementação de uma metodologia e determinação de valores de referência de esteróis em amostras de líquido amniótico	por
dc.type	master thesis
dspace.entity.type	Publication
rcaap.rights	openAccess	por
rcaap.type	masterThesis	por
thesis.degree.discipline	Bioquímica	por
thesis.degree.level	Mestre	por
thesis.degree.name	Dissertação apresentada à Universidade da Beira Interior para a obtenção do grau de mestre em Bioquímica	por