Publication
Estudo das condições de purificação de DNA plasmídico na sua atividade biológica em terapia do cancro
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia::Bioquímica | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Queiroz, João António de Sampaio Rodrigues | |
| dc.contributor.advisor | Sousa, Fani Pereira de | |
| dc.contributor.author | Azevedo Junior, Gilson | |
| dc.date.accessioned | 2019-08-06T11:02:18Z | |
| dc.date.available | 2019-08-06T11:02:18Z | |
| dc.date.issued | 2019-07 | |
| dc.description.abstract | Existem mais de 200 tipos de cancro descritos e em mais de 50% dos casos, o gene supressor de tumor TP53 encontra-se mutado. Esta condição promove diferentes alterações aos mecanismos fisiológicos, passando a célula a adquirir auto-suficiência em sinais de crescimento; insensibilidade a sinais de anticrescimento; angiogénese sustentada; capacidade de invasão de tecido e metástase; potencial replicativo ilimitado e evasão de morte celular programada (apoptose). Numa situação normal, a proteína p53 protege as células contra a tumorigénese detetando stresse metabólico ou danos no DNA, e o seu mecanismo de resposta é dependente do tipo de célula e da lesão que está presente. Em resposta ao stresse, a p53 pode levar a célula à senescência, autofagia, paragem do ciclo celular, reparação do DNA e apoptose. Dessa forma, é razoável supor que o reestabelecimento da função da p53 possa controlar a proliferação do cancro. O presente trabalho pretende descrever o efeito que as condições usadas na purificação do pDNA, podem ter na sua estabilidade e atividade. Assim, é apresentada a aplicação de três colunas cromatográficas para purificar a isoforma superenrolada de pcDNA3- FLAG-p53, um plasmídeo terapêutico. A estabilidade e a atividade biológica do plasmídeo foram posteriormente avaliadas por dicroísmo circular, potencial zeta, expressão de proteína e apoptose pelo teste ELISA. Os resultados apresentados mostram que a topologia B do DNA foi mantida nas três amostras purificadas por cromatografia de afinidade e que a maior bioatividade foi verificada para o pDNA purificado através da matriz de arginina macroporosa, seguido por monólito de histidina e histidina agarose. Apesar do grau de pureza de 92% e rendimento de recuperação de 43% do sc pDNA isolado por arginina macroporosa, esta amostra permitiu a obtenção de maiores níveis de expressão da proteína terapêutica e consequentemente maior efeito apoptótico que as outras amostras de pDNA purificado por histidina agarose (grau de pureza de 97% e recuperação de 42%) e monólito de histidina (grau de pureza de 100% e rendimento de recuperação de 72%). Esse comportamento pode estar relacionado com as condições cromatográficas usadas na matriz de arginina macroporosa, nomeadamente a baixa força iónica de NaCl, em tampão de pH neutro e baixas temperaturas, quando comparadas às condições de elevada força iónica, usando (NH4)2SO4 e temperatura ambiente ou pH ácido, aquando da purificação do pDNA com matrizes de histidina. | pt_PT |
| dc.description.abstract | There are more than 200 types of cancer described and in more than 50% of cases, the tumour suppressor gene TP53 is damaged, leading the cell to different alterations on physiological mechanisms, gaining self-sufficiency in growth signals; insensitivity to antigrowth signals; sustained angiogenesis; ability for tissue invasion and metastasis; limitless replicative potential and evasion of programmed cell death (apoptosis). In normal situations, the protein p53 protects the cells against tumorigenesis detecting metabolic stress or DNA damage, and its response mechanism is dependent on the kind of cell and injury caused. In response to stress, p53 could lead the cell to senescence, autophagy, cell cycle arrest, DNA repair and apoptosis. In this way, it is reasonable to assume that the reestablishment of p53 function, may restrain the proliferation of cancer. The present work describes the effect of the chromatographic conditions used for pDNA purification on the stability and bioactivity of pDNA. Thus, three chromatographic columns were used to purify the supercoiled isoform of pcDNA3-FLAG-p53, a therapeutic plasmid. The stability and biological activity were evaluated by circular dichroism, zeta potential, expression of protein and apoptosis by ELISA assay. The results showed that the B-DNA topology was maintained for the three pDNA samples purified by affinity chromatography, but the bioactivity was better when using a pDNA purified through arginine macroporous, followed by histidine monolith and histidine agarose. Despite of the purity degree of 92% and recovery yield of 43% of the sc pDNA isolated by arginine macroporous, this sample was able to induce a higher p53 protein expression level and consequently a higher apoptotic effect, than other samples obtained by histidine agarose (purity degree of 97% and recovery of 42%) and histidine monolith (purity degree of 100% and recovery yield of 72%). This behavior can be related with the chromatographic conditions used in arginine macroporous, namely the low ionic strength of NaCl, at neutral pH and lower temperatures, when compared to the high ionic strength of (NH4)2SO4 and room temperature or acidic pH used in histidine-based columns. | pt_PT |
| dc.description.sponsorship | Apoio financeiro concedido pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (203482/2014-0) | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 101558449 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/7157 | |
| dc.language.iso | por | pt_PT |
| dc.subject | Cancro - Terapia genética - DNA plasmídico | pt_PT |
| dc.subject | Cancro - Terapia genética - Cromatografia de afinidade | pt_PT |
| dc.subject | Cancro - Terapia genética - Purificação de anticorpos | pt_PT |
| dc.title | Estudo das condições de purificação de DNA plasmídico na sua atividade biológica em terapia do cancro | pt_PT |
| dc.type | doctoral thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| person.familyName | Azevedo Junior | |
| person.givenName | Gilson | |
| person.identifier.orcid | 0000-0001-7078-9631 | |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | doctoralThesis | pt_PT |
| relation.isAuthorOfPublication | 5644046b-cde7-42fc-9036-d93cf20e4a31 | |
| relation.isAuthorOfPublication.latestForDiscovery | 5644046b-cde7-42fc-9036-d93cf20e4a31 | |
| thesis.degree.name | Doutoramento em Bioquímica | pt_PT |
Files
Original bundle
1 - 1 of 1
No Thumbnail Available
- Name:
- Gilson Azevedo_Tese Completa julho.pdf
- Size:
- 2.49 MB
- Format:
- Adobe Portable Document Format
License bundle
1 - 1 of 1
No Thumbnail Available
- Name:
- license.txt
- Size:
- 1.71 KB
- Format:
- Item-specific license agreed upon to submission
- Description: