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Advisor(s)
Abstract(s)
The importance of RNA in numerous biological processes has increased substantially over
recent years. Small RNAs (sRNAs) are increasingly recognized as crucial regulatory molecules
in all organisms and the specificity and potency of small RNAs suggest that they might be
promising as therapeutic agents, namely in interference RNA strategies. These strategies
generally rely on the use of synthetic siRNA. Although the synthesis of siRNA can be very
efficient, the oligonucleotides typically present contaminants, which leads to the need for
the development of new processes for the production of highly purified and clinically suitable
siRNA oligonucleotides for use in therapy. Rhodovulum sulfidophilum have the ability to
produce active extracellular sRNA; therefore, the potential use of this organism to obtain
functional recombinant sRNA with large therapeutic applicability is eminent. However, the
success of sRNA therapies depends upon the ability to selectively and efficiently deliver
therapeutic sRNA to target organ with minimal toxicity. For this purpose, novel nanodevices
and vehicles have been formulated with materials that possess ideal intrinsic transfection and
unpacking characteristics.
In order to optimize the production of Rhodovulum sulfidophilum DSM 1374 extracellular
sRNAs, the influence of temperature and NaCl concentration on the specific growth rate and
in extracellular sRNA production were evaluated. The experiments performed showed that
the aerobic cultivation in the dark, with nutrient broth medium containing 3 % NaCl at 30 ºC,
conducted to a maximum production of extracellular sRNAs yielding 197 ± 0.55 Mg/mL. For
the improvement of the biological effect in RNAi-based therapies, the design and synthesis of
optimal non-viral vectors for sRNA delivery, using commercial polymers, such as
Polyethylenimine, Chitosan and Poly(allylamine) were performed. The results obtained
showed that the structural and physicochemical properties (size, zeta potential and
morphology) of the nanoparticles are strongly dependent on polycation molecular weight,
charge density and structure, and also on the formulation ratio of amine to phosphate groups
present in the RNA (N/P ratio) and, ultimately, alterations in these parameters influence the
association efficiency and stability of sRNA. Overall, the implementation of this cutting-edge
approach provides the basis for the future development of effective sRNA-based gene therapy
applications.
A importância do RNA em numerosos processos biológicos tem aumentado substancialmente nos últimos anos. Os RNAs de baixo peso molecular (sRNAs) são cada vez mais reconhecidos como moléculas reguladoras que desempenham papéis cruciais em todos os organismos. Devido à sua especificidade e eficácia, os sRNAs podem ser considerados promissores como agentes terapêuticos, nomeadamente na terapia baseada em RNA de interferência. Estas estratégias geralmente são baseadas na utilização de siRNA sintético. Embora a síntese de siRNA possa ser muito eficiente, verifica-se normalmente a presença de oligonucleótidos contaminantes, o que desencadeia a necessidade do desenvolvimento de novos processos de produção de siRNA com elevado grau de pureza, adequado para uso em terapia. A bactéria Rhodovulum sulfidophilum tem a capacidade de secretar sRNA, existindo assim a possibilidade do uso deste microrganismo para a obtenção de sRNA recombinante, com elevada aplicabilidade terapêutica. No entanto, o sucesso das terapias baseadas em RNA depende também da capacidade de entrega do sRNA terapêutico, de forma selectiva e eficiente, aos órgãos-alvo, com a mínima toxicidade. Para este efeito, foram formuladas nanopartículas e outros veículos de entrega com elevada capacidade de transfecção e que possuem características ideais para a libertação do material genético. A fim de optimizar a produção de sRNAs extracelulares usando a bactéria Rhodovulum sulfidophilum DSM 1374 foi estudada a influência da temperatura e concentração de NaCl no crescimento e na produção de sRNA extracelulares. Os ensaios realizados demonstraram que o crescimento em aerobiose, na ausência de luz, a 30 ºC, em meio NB suplementado com 3 % de NaCl, conduziu a uma produção máxima 197 ± 0,55 Mg/mL de sRNAs extracelulares. Tendo em vista o aperfeiçoamento das terapias baseadas no RNAi foram desenvolvidos vectores não virais para a entrega de siRNA usando polímeros comerciais, tais como polietilimina, quitosano e poli(alilamina). Os resultados obtidos demonstraram que as propriedades estruturais (tamanho, potencial zeta e morfologia) das nanopartículas são fortemente dependentes do peso molecular, da densidade de carga e estrutura do policatião. Para além destas observações, verificou-se que o quociente entre os grupos amina do policatião e os grupos fosfato do RNA (N/P rácio) também afecta a formulação das nanopartículas. Por conseguinte, quaisquer alterações nestes parâmetros irão influenciar a eficiência de encapsulação, bem como a protecção e estabilidade do sRNA. A conjugação destas tecnologias inovadoras oferece um ponto de partida para o futuro desenvolvimento de aplicações baseadas em siRNA com relevância terapêutica.
A importância do RNA em numerosos processos biológicos tem aumentado substancialmente nos últimos anos. Os RNAs de baixo peso molecular (sRNAs) são cada vez mais reconhecidos como moléculas reguladoras que desempenham papéis cruciais em todos os organismos. Devido à sua especificidade e eficácia, os sRNAs podem ser considerados promissores como agentes terapêuticos, nomeadamente na terapia baseada em RNA de interferência. Estas estratégias geralmente são baseadas na utilização de siRNA sintético. Embora a síntese de siRNA possa ser muito eficiente, verifica-se normalmente a presença de oligonucleótidos contaminantes, o que desencadeia a necessidade do desenvolvimento de novos processos de produção de siRNA com elevado grau de pureza, adequado para uso em terapia. A bactéria Rhodovulum sulfidophilum tem a capacidade de secretar sRNA, existindo assim a possibilidade do uso deste microrganismo para a obtenção de sRNA recombinante, com elevada aplicabilidade terapêutica. No entanto, o sucesso das terapias baseadas em RNA depende também da capacidade de entrega do sRNA terapêutico, de forma selectiva e eficiente, aos órgãos-alvo, com a mínima toxicidade. Para este efeito, foram formuladas nanopartículas e outros veículos de entrega com elevada capacidade de transfecção e que possuem características ideais para a libertação do material genético. A fim de optimizar a produção de sRNAs extracelulares usando a bactéria Rhodovulum sulfidophilum DSM 1374 foi estudada a influência da temperatura e concentração de NaCl no crescimento e na produção de sRNA extracelulares. Os ensaios realizados demonstraram que o crescimento em aerobiose, na ausência de luz, a 30 ºC, em meio NB suplementado com 3 % de NaCl, conduziu a uma produção máxima 197 ± 0,55 Mg/mL de sRNAs extracelulares. Tendo em vista o aperfeiçoamento das terapias baseadas no RNAi foram desenvolvidos vectores não virais para a entrega de siRNA usando polímeros comerciais, tais como polietilimina, quitosano e poli(alilamina). Os resultados obtidos demonstraram que as propriedades estruturais (tamanho, potencial zeta e morfologia) das nanopartículas são fortemente dependentes do peso molecular, da densidade de carga e estrutura do policatião. Para além destas observações, verificou-se que o quociente entre os grupos amina do policatião e os grupos fosfato do RNA (N/P rácio) também afecta a formulação das nanopartículas. Por conseguinte, quaisquer alterações nestes parâmetros irão influenciar a eficiência de encapsulação, bem como a protecção e estabilidade do sRNA. A conjugação destas tecnologias inovadoras oferece um ponto de partida para o futuro desenvolvimento de aplicações baseadas em siRNA com relevância terapêutica.
Description
Keywords
Ácido ribonuclico (RNA) RNA - siRNA Nanopartículas Poliplexos