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Abstract(s)
The demanding applications of nanocarriers in cancer biology require the existence of testing platforms that mimic the in vivo tumor microenvironment and its unique biological features. For this, highly informative methodologies such as animal experimentation are the current gold-standard. However, very recent reports issued by regulatory agencies appeal for the reduction of the used animal research models due to economical and ethical issues, thus evidencing the urgent necessity for novel alternatives. Co-culture cell models have the potential to bridge the gap between the required reduction of animal use and the existence of suitable models that closely reproduce in vivo tumors. This is a novel type of in vitro cell culture that is mainly characterized by the culture of cancer cells in contact with stromal cells, mimicking the tumor microenvironment in vitro trough the establishment of cancer-stroma synergic interactions. However, this evaluation was until now limited to co-culture systems established with precise cell ratios, not addressing the natural heterogeneity commonly found in tumors of different patients. The research work presented in this thesis describes the development and optimization of novel 2D co-culture models of breast and cervical cancers with various cell-to-cell ratios, in order to unravel the influence of heterogeneous conditions on the evaluation of nanocarrier biological performance and ultimately in the therapeutic outcome. As a proof of concept these novel platforms were used to evaluate a multifunctional gene delivery system designed for cancer therapy and revealed that in fact different co-culture ratios may influence the overall assessment of nanocarrier targeting specificity. In addition, since recent reports demonstrate the high influence of the 3D architecture of tumor masses in the response to anti-cancer drugs or delivery systems, the engineering and optimization of suitable substrates for generation of organotypic 3D co-culture models with various cancer-fibroblast cell ratios was also investigated. The 3D multicelular spheroid models of breast and cervix cancer produced at various time points, possess all the major characteristics of in vivo tumors including the structural rearrangement, the diffusional limit of oxygen or nutrients and most importantly, the distinctive necrotic core of solid tumors. Overall, these newly developed co-culture and 3D models assume crucial importance for the future design and optimization of new drug delivery providing a new level of in vitro reproducibility of in vivo tumors.
Os recentes avanços na área da Nanotecnologia abriram novas oportunidades para o desenvolvimento de novos nano-sistemas como as nanopartículas para entrega de fármacos ou de informação genética com potencial para serem usadas futuramente na terapia do cancro. Todavia, para que as suas aplicações terapêuticas sejam significativas num contexto clínico, estes sistemas devem ser testados em modelos que representem o mais aproximadamente possível as propriedades únicas que o microambiente tumoral tem in vivo. Por forma a atingir este objetivo, vários protocolos experimentais usam modelos animais para avaliar a atividade biológica de nano transportadores. No entanto, recentemente, as diferentes agências regulatórias têm apelado pela aplicação da regra dos 3Rs (Reduzir, Reutilizar, Reciclar) em relação ao uso de animais como modelos para estudos experimentais em fases pré-clinicas, não só devido aos problemas económicos e legais associados ao seu uso, mas também devido a inconvenientes éticos, e à variabilidade dos resultados obtidos quando comparados com aqueles adquiridos em estudos clínicos com humanos. Neste contexto, tem-se procurado desenvolver novas alternativas que permitam reproduzir o que ocorre in vivo. A cultura in vitro de células tumorais em co-cultura com outras células presentes no microambiente tumoral surge como uma abordagem muito promissora no que diz respeito a mimetizar as caraterísticas dos variados tipos tumores. Esta metodologia permite estudar de uma forma abrangente a biologia dos tumores, sob variadas condições e até mesmo testar, de uma forma rápida, novos fármacos ou sistemas de entrega direcionada. O contacto direto entre as células cancerígenas e as células do estroma, reproduzem as interações sinergéticas que ocorrem no microambiente tumoral. Contudo, estes sistemas de culturas celulares são usualmente desenvolvidos tendo por base um número fixo de células tumorais em relação às células do estroma. De facto, até à data apenas foram descritos testes de novos agentes anti-tumorais ou de novos sistemas de entrega em co-culturas com apenas um rácio de células, sendo que esta abordagem não permite assim analisar a heterogeneidade natural dos tumores. Desta forma, o trabalho de investigação desenvolvido nesta tese descreve desenvolvimento e otimização de novos modelos 2D de co-culturas do cancro da mama e do colo do útero. Para tal, foram usados vários rácios de células cancerígenas células normais do estroma, com o intuito de representar a distribuição celular em diferentes tumores. Adicionalmente, pretende-se também verificar de que forma estas diferentes condições influenciam a atividade dos novos sistemas de entrega de drogas e consequentemente a sua eficácia terapêutica. Os resultados obtidos demonstraram uma influência evidente dos fibroblastos, sobre o comportamento das células cancerígenas. Inicialmente, foi possível verificar uma alteração na organização estrutural das co-culturas, quando comparadas com as monoculturas de controlo. Além disto, foi também observado um aumento na viabilidade celular na presença de fibroblastos, tendo sido obtida uma correlação entre o tempo de co-cultura e um aumento de proliferação celular. Após a demonstração do sucesso da otimização destas plataformas, foram testadas nanopartículas funcionalizadas nas várias co-culturas desenvolvidas. Os resultados obtidos na microscopia confocal e citometria de fluxo demonstraram que o uso de diferentes rácios celulares pode de facto influenciar a avaliação da especificidade de nano transportadores. Estes resultados evidenciam assim que, os mesmos sistemas de entrega podem atuar de forma diferente, de paciente para paciente. Para além do desenvolvimento destes sistemas de co-culturas, foi também otimizada a produção de novos modelos de culturas tridimensionais. Estes modelos 3D, mais comumente chamados de esferoides, conseguem mimetizar os tumores sólidos, pois são constituídos por vários tipos de células e com o decorrer do tempo adquirirem propriedades únicas, nomeadamente uma superfície constituída por células com elevada proliferação, que mimetizam as zonas do tumor irrigadas por vasos sanguíneos e um núcleo necrótico, que corresponde às zinas do tumor com baixa densidade de vasos. Para promover a formação destes modelos foi utilizada a técnica de cultura celular com sobreposição líquida em conjugação com agitação horizontal. Esta nova abordagem permitiu evitar a adesão das células e promoveu a formação de esferoides 3D com morfologias bem definidas e reprodutíveis. Para a formação destes modelos fibroblastos revelaram um papel fundamental visto que as interações que se estabelecem entre os dois tipos celulares são essenciais para formar esferoides coesos e com um gradiente de densidades celulares da periferia para o núcleo. Em geral, os novos modelos de co-culturas desenvolvidos assumem um papel crucial no futuro desenvolvimento e investigação de novos nano transportadores, já que estes serão na prática direcionados para os tumores. Por outro lado, os modelos 3D permitem reproduzir com exatidão o que acontece in vivo, criando um conjunto de ferramentas que poderão contribuir para aperfeiçoar as terapias anti-tumorais.
Os recentes avanços na área da Nanotecnologia abriram novas oportunidades para o desenvolvimento de novos nano-sistemas como as nanopartículas para entrega de fármacos ou de informação genética com potencial para serem usadas futuramente na terapia do cancro. Todavia, para que as suas aplicações terapêuticas sejam significativas num contexto clínico, estes sistemas devem ser testados em modelos que representem o mais aproximadamente possível as propriedades únicas que o microambiente tumoral tem in vivo. Por forma a atingir este objetivo, vários protocolos experimentais usam modelos animais para avaliar a atividade biológica de nano transportadores. No entanto, recentemente, as diferentes agências regulatórias têm apelado pela aplicação da regra dos 3Rs (Reduzir, Reutilizar, Reciclar) em relação ao uso de animais como modelos para estudos experimentais em fases pré-clinicas, não só devido aos problemas económicos e legais associados ao seu uso, mas também devido a inconvenientes éticos, e à variabilidade dos resultados obtidos quando comparados com aqueles adquiridos em estudos clínicos com humanos. Neste contexto, tem-se procurado desenvolver novas alternativas que permitam reproduzir o que ocorre in vivo. A cultura in vitro de células tumorais em co-cultura com outras células presentes no microambiente tumoral surge como uma abordagem muito promissora no que diz respeito a mimetizar as caraterísticas dos variados tipos tumores. Esta metodologia permite estudar de uma forma abrangente a biologia dos tumores, sob variadas condições e até mesmo testar, de uma forma rápida, novos fármacos ou sistemas de entrega direcionada. O contacto direto entre as células cancerígenas e as células do estroma, reproduzem as interações sinergéticas que ocorrem no microambiente tumoral. Contudo, estes sistemas de culturas celulares são usualmente desenvolvidos tendo por base um número fixo de células tumorais em relação às células do estroma. De facto, até à data apenas foram descritos testes de novos agentes anti-tumorais ou de novos sistemas de entrega em co-culturas com apenas um rácio de células, sendo que esta abordagem não permite assim analisar a heterogeneidade natural dos tumores. Desta forma, o trabalho de investigação desenvolvido nesta tese descreve desenvolvimento e otimização de novos modelos 2D de co-culturas do cancro da mama e do colo do útero. Para tal, foram usados vários rácios de células cancerígenas células normais do estroma, com o intuito de representar a distribuição celular em diferentes tumores. Adicionalmente, pretende-se também verificar de que forma estas diferentes condições influenciam a atividade dos novos sistemas de entrega de drogas e consequentemente a sua eficácia terapêutica. Os resultados obtidos demonstraram uma influência evidente dos fibroblastos, sobre o comportamento das células cancerígenas. Inicialmente, foi possível verificar uma alteração na organização estrutural das co-culturas, quando comparadas com as monoculturas de controlo. Além disto, foi também observado um aumento na viabilidade celular na presença de fibroblastos, tendo sido obtida uma correlação entre o tempo de co-cultura e um aumento de proliferação celular. Após a demonstração do sucesso da otimização destas plataformas, foram testadas nanopartículas funcionalizadas nas várias co-culturas desenvolvidas. Os resultados obtidos na microscopia confocal e citometria de fluxo demonstraram que o uso de diferentes rácios celulares pode de facto influenciar a avaliação da especificidade de nano transportadores. Estes resultados evidenciam assim que, os mesmos sistemas de entrega podem atuar de forma diferente, de paciente para paciente. Para além do desenvolvimento destes sistemas de co-culturas, foi também otimizada a produção de novos modelos de culturas tridimensionais. Estes modelos 3D, mais comumente chamados de esferoides, conseguem mimetizar os tumores sólidos, pois são constituídos por vários tipos de células e com o decorrer do tempo adquirirem propriedades únicas, nomeadamente uma superfície constituída por células com elevada proliferação, que mimetizam as zonas do tumor irrigadas por vasos sanguíneos e um núcleo necrótico, que corresponde às zinas do tumor com baixa densidade de vasos. Para promover a formação destes modelos foi utilizada a técnica de cultura celular com sobreposição líquida em conjugação com agitação horizontal. Esta nova abordagem permitiu evitar a adesão das células e promoveu a formação de esferoides 3D com morfologias bem definidas e reprodutíveis. Para a formação destes modelos fibroblastos revelaram um papel fundamental visto que as interações que se estabelecem entre os dois tipos celulares são essenciais para formar esferoides coesos e com um gradiente de densidades celulares da periferia para o núcleo. Em geral, os novos modelos de co-culturas desenvolvidos assumem um papel crucial no futuro desenvolvimento e investigação de novos nano transportadores, já que estes serão na prática direcionados para os tumores. Por outro lado, os modelos 3D permitem reproduzir com exatidão o que acontece in vivo, criando um conjunto de ferramentas que poderão contribuir para aperfeiçoar as terapias anti-tumorais.
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Keywords
Células tumorais - Co-culturas 2D Esteroides multicelulares Microambiente tumoral Nanosistemas - Entrega fármacos - Aplicações Co-culturas células in vitro