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Authors
Abstract(s)
Ion exchange chromatography is one of the most used methods in downstream processing for protein purification due to its usual high dynamic binding capacity (DBC) and versatility. However, when starting with high conductivity feedstocks (=15mS.cm-1), additional steps are required before loading, such as dilution and/or diafiltration, which increases process time and costs. Thus, there is a need of specifically designed resins for the direct processing of biological feedstocks or intermediate fractions without these extra steps. One example is the Toyopearl NH2-750F support, referred as a “salt tolerant chromatography” resin, used in this work. This resin can to maintain high DBC at conductivities greater than 30mS.cm-1, making it ideal for protein initial capture step or even for polishing steps (antibody aggregates removal). However, its retention and separation mechanisms are still not fully understood.
Flow microcalorimetry may provide an improved understanding of the driving forces and mechanisms involved in the interaction process during biomolecules adsorption in chromatography due to its ability to measure adsorption enthalpy in the flow mode. Furthermore, adsorption isotherms and retention studies using the Stoichiometric Displacement model, the Steric Mass Action model, Yamamoto’s approach and the Preferential Interaction analysis may also successfully elucidate biomolecule adsorption onto a chromatographic resin. Using all the upmentioned tools, this work aims to elucidate how the salt concentration, pH and protein surface concentration affect the adsorption mechanism of BSA, as a model protein, onto a salt tolerant anion exchange support (Toyopearl NH2-750F).
FMC results show that under all the studied conditions, the adsorptive process is enthalpically driven. At pH 8.0, a single exothermic event was observed, with higher enthalpic values when compared to pH 6.0, probably due to the establishment of higher number of binding points demonstrated by the Stoichiometric Displacement model and the Yamamoto’s approach. Nevertheless, at pH 6.0, a second chronological event occurs during BSA adsorption, leading us to believe that the protein is organizing itself on the support surface, resulting in secondary adsorption and/or surface transport phenomena. This specific adsorption (a single exothermic event) at pH 8.0 may be related to the establishment of hydrogen bonding in addition to the electrostatic interactions. Contrary to what occurs at pH 6.0, at pH 8.0 not all the ligand amines are protonated, being available to establish hydrogen bonding that requires a specific footprint on the support surface and consequently, a greater ability to sustain the adsorption at high salt concentrations.
Additionally, the presence of salt also promotes changes in the peak areas. As expected, salt shield the protein and ligand surface, weakening the electrostatic attractive forces, which led to a decrease of the first exothermic signal at pH 6.0 and a decrease of the single exothermic event at pH 8.0. On the other hand, the second exothermic peak at pH 6.0, increases with the increase of salt concentration, thus, as weaker is the initial adsorption (due to the increasing of salt concentration); greater will be the amount of BSA molecules that suffer secondary adsorption events.
All these results may be used for model development, computer molecular simulations, and theoretical approaches development, confirming that FMC is a powerful technique to further elucidate the complexity of protein adsorption during a chromatographic process.
Nas últimas décadas, o crescente interesse na aplicação de produtos biológicos, nas mais diversas áreas, veio revolucionar as indústrias de biotransformação, cosmética, diagnóstico, investigação e desenvolvimento, alimentar e farmacêutica. No caso da indústria farmacêutica, é crucial a obtenção de produtos em elevada quantidade, para poderem ser disponibilizados a todos os pacientes e com elevados níveis de pureza e homogeneidade de forma a assegurar uma boa resposta terapêutica e a segurança dos doentes. Com o desenvolvimento da tecnologia recombinante e dos processos de fermentação, é já possivel obter rendimentos elevados durante o processo de “upstream” de biofármacos, redirecionando o foco das empresas em mitigar antes os custos associados ao processo de “downstream”, que para garantir a qualidade do produto engloba sempre nas suas etapas, passos de separação e de purificação, reconhecidos como os mais caros. Assim, a redução de custos pode ser conseguida aumentando o rendimento (quantidade de produto obtido por unidade de tempo) destes passos ou reduzindo o número dos mesmos na obtenção dos biofármacos com os níveis de pureza desejados. Devido à sua elevada eficiência e capacidade de adsorção para diferentes tipos de biomoléculas, as cromatografias de afinidade, de troca iónica e de interação hidrofóbica têm sido das técnicas mais utilizadas nas das etapas de separação e purificação. No entanto, com o intuito de ultrapassar algumas das desvantagens associadas aos ligandos convencionais, recentemente, as equipas de investigação e desenvolvimento de suportes cromatográficos têm vindo a investir no design de novos ligandos, capazes de conjugar múltiplas interações. Um bom exemplo é a cromatografia de troca aniónica tolerante a sal, que permite obter as vantagens inerentes aos suportes de troca iónica (elevada versatilidade e elevadas capacidades de ligação sem comprometer a estrutura das biomoléculas), mas superando a grande desvantagem da necessidade de diluir ou diafiltrar as amostras a processar, de forma a baixar a condutividade dos meios. Está já descrito na literatura que o uso de poliaminas (aminas primárias e secundárias) como ligando, em detrimento de aminas quaternárias (ligando Q), é uma das explicações para as propriedades de tolerância ao sal devido à combinação de interações eletrostáticas com pontes de hidrogénio. A possibilidade destes ligandos em manter a adsorção de uma amostra em condições de condutividades superiores a 30mS.cm-1, faz com estes novos suportes possam ser usados tanto nos passos de captura, fazendo um processamento direto de amostras biológicas, como nos passos de polimento devido à elevada resolução obtida na separação de agregados ou formas diméricas. Contudo, o aumento da complexidade destas novas alternativas faz aumentar drasticamente a dificuldade em compreender os mecanismos de interação envolvidos no processo de adsorção. A compreensão destes mecanismos, é crucial para o desenvolvimento de futuros suportes, simulações moleculares e ainda na transposição de uma escala laboratorial para uma escala industrial. A análise dos eventos termodinâmicos dos processos de adsorção através da Microcalorimetria de Fluxo (FMC) tem vindo a provar ser uma importante ferramenta na obtenção de uma melhor compreensão das forças motrizes, dos mecanismos e das cinéticas envolvidas no processo de adsorção de biomoléculas em diferentes sistemas cromatográficos. O FMC é uma técnica em que o modo de funcionamento é muito semelhante ao de um sistema cromatográfico, mas com a particularidade de ter acoplado à coluna dois termístores que permitem medir in situ variações de energia causadas pela adsorção das biomoléculas ao suporte. Assim, recorrendo ao uso da técnica de FMC, o objetivo deste trabalho foca-se na compreensão da influência de fatores como o pH e a concentração de sal no mecanismo de adsorção da albumina bovina sérica (BSA), a suportes de cromatografia de troca aniónica tolerante a sal. A fim de complementar e interpretar os resultados obtidos por FMC, foram ainda obtidas as isotérmicas de adsorção e realizados estudos de retenção. Estes estudos foram associados com diferentes modelos teóricos, nomeadamente: a teoria de “Langmuir”, o modelo de “Stoichiometric displacement” (SD), o modelo de Yamamoto, o modelo de “Steric Mass Action” (SMA) e a análise de “Preferential interaction” (análise de Perkins). Os resultados obtidos por microcalorimetria de fluxo demonstraram que as forças motrizes do processo de adsorção em suportes tolerantes a sal são diferentes das dos suportes puramente iónicos, como o Toyopearl DEAE 650M, Toyopearl GigaCap Q-650M e TSKgel SuperQ 5PW. Nestes, como previamente demonstrado pelo nosso grupo de investigação1, revelou-se a presença de um evento endotérmico inicial relacionado com o processo de dessolvatação, seguido de um evento exotérmico associado à interação entre a proteína e o suporte. No caso do suporte tolerante a sal, na ausência e na presença de sal, observou-se sempre um único pico exotérmico a pH 8,0 e o aparecimento de dois picos exotérmicos a pH 6,0, onde o segundo pico ocorre após a amostra que contém proteína ser totalmente substituída pela solução tampão no interior da coluna. Este “timing” leva-nos a crer que existe adsorção secundária da proteína após a criação de novos locais de ligação resultantes de reorganização da mesma à superfície do suporte. A pH 8,0 não se observa este segundo evento, indicando que a adsorção inicial da proteína é forte e favorável o suficiente para não sofrer quaisquer alterações. Esta conformação preferencial a pH 8,0 pode estar relacionada a formação de pontes de hidrogénio para alem das interações electroestáticas. Apesar de o fornecedor da resina Toyopearl NH2-750F referir que o pKa do ligando é de 8,5, está bem descrito na literatura2 que o pKa de cada grupo de amina é influenciado pela sua posição no ligando e pelo tamanho da cadeia alifática. Blagbrough et al.2 refere ainda que poliaminas como a espermina (pKa=11,1) apenas a pH ligeiramente abaixo de 6,8 é que possui uma protonação completa de todas as aminas. Traspondo estes conceitos para o nosso trabalho, é plausível que a pH 6,0 todas as aminas já estejam protonadas fazendo com que as forças motrizes de adsorção sejam maioritariamente eletrostáticas enquanto que a pH 8,0, existam ainda aminas não protonadas que ficam disponíveis para estabelecer pontes de hidrogénio. Estas múltiplas interações podem requerer uma conformação preferencial da proteína-ligando impedindo posteriores reorganizações e conferindo uma elevada tolerância ao sal. Com o aumento da concentração de sal observam-se também diferenças significativas nas áreas dos picos. A pH 6,0, com o aumento da concentração de sal, verificou-se que a energia associada ao segundo evento aumenta, ao contrário do que se verifica no primeiro evento exotérmico, onde o aumento da concentração de sal provoca uma diminuição da energia libertada. O sal tem a propriedade de blindar as interações eletrostáticas e enfraquecer a interação durante o processo de adsorção, por isso, é intuitivo pensar que quanto maior a concentração de sal no meio, mais fraca será a interação inicial proteína-suporte (diminuição do primeiro pico exotérmico), possibilitando a reorganização da proteína à superfície e a formação de interações mais favoráveis (aumento do segundo evento exotérmico). Como esperado, a pH 8,0 os resultados demonstraram-se semelhantes aos observados a pH 6,0 para o primeiro evento exotérmico, observando-se a sua diminuição com o aumento da concentração de sal. A aplicação dos modelos veio suportar as explicações avançadas pela interpretação dos resultados de FMC. A pH 8,0 a BSA possui uma maior pegada à superfície do ligando (Steric mass action), fazendo com que se estabeleça um maior número de pontos de interação proteína-suporte (Stoichiometric Displacement e modelo de Yamamoto), e consequentemente uma maior remoção de moléculas de água e iões à superfície (análise de Perkins). Isto indica-nos que a proteína adota uma conformação especifica e altamente estável devido ao à formação múltiplas interações (eletrostáticas e pontes de hidrogénio), que dificulta a disrupção da adsorção por parte do sal, daí se ter observado uma maior tolerância ao sal a pH 8,0 do que a pH 6,0 (com base nas isotérmicas de adsorção, observa-se uma redução mais acentuada da capacidade máxima a pH 6,0 do que a pH 8,0 com o aumento da concentração e sal). Estes resultados também são claros quando se observa a diferença dos valores energéticos da adsorção primária, sendo claramente superiores a pH 8,0 devido ao maior número de locais de interação. Por fim, nas injeções a pH 8,0, mas perto do limite de saturação da coluna, foi observado a presença de um segundo evento exotérmico semelhante aos obtidos a pH 6,0. Estes resultados reforçam ainda mais a teoria de que a pegada da BSA à superfície é superior a pH 8,0, isto porque quando um número muito elevado de moléculas de BSA entram em contacto com o suporte, a competição pelos locais de ligação torna-se mais significativa e nem todas as moléculas conseguem adotar a posição de interação preferencial com o suporte, ficando então sujeitas a sofrer fenómenos semelhantes aos descritos a pH 6,0. Todos estes resultados confirmam que, para uma visão mais consistente dos mecanismos de adsorção, a utilização da microcalorimetria de fluxo mostra-se de grande interesse no estudo sistemático dos diferentes suportes cromatográficos. Para além disso, também a modelação associada a estudos de estrutura molecular demonstraram ser ferramentas importantes para a elucidação do complexo processo que é a adsorção de proteínas. Modelações teóricas, semi-empíricas e simulações computacionais relacionadas com o mecanismo de adsorção, especialmente de moléculas com alto peso molecular, procuram contabilizar estes eventos entalpicos sempre com o objetivo final de desenvolver não só processos cromatográficos mais rápidos, eficazes e com melhores rendimentos, como também simplificar e diminuir os custos associados à produção biotecnológica de biomoléculas com interesse farmacêutico.
Nas últimas décadas, o crescente interesse na aplicação de produtos biológicos, nas mais diversas áreas, veio revolucionar as indústrias de biotransformação, cosmética, diagnóstico, investigação e desenvolvimento, alimentar e farmacêutica. No caso da indústria farmacêutica, é crucial a obtenção de produtos em elevada quantidade, para poderem ser disponibilizados a todos os pacientes e com elevados níveis de pureza e homogeneidade de forma a assegurar uma boa resposta terapêutica e a segurança dos doentes. Com o desenvolvimento da tecnologia recombinante e dos processos de fermentação, é já possivel obter rendimentos elevados durante o processo de “upstream” de biofármacos, redirecionando o foco das empresas em mitigar antes os custos associados ao processo de “downstream”, que para garantir a qualidade do produto engloba sempre nas suas etapas, passos de separação e de purificação, reconhecidos como os mais caros. Assim, a redução de custos pode ser conseguida aumentando o rendimento (quantidade de produto obtido por unidade de tempo) destes passos ou reduzindo o número dos mesmos na obtenção dos biofármacos com os níveis de pureza desejados. Devido à sua elevada eficiência e capacidade de adsorção para diferentes tipos de biomoléculas, as cromatografias de afinidade, de troca iónica e de interação hidrofóbica têm sido das técnicas mais utilizadas nas das etapas de separação e purificação. No entanto, com o intuito de ultrapassar algumas das desvantagens associadas aos ligandos convencionais, recentemente, as equipas de investigação e desenvolvimento de suportes cromatográficos têm vindo a investir no design de novos ligandos, capazes de conjugar múltiplas interações. Um bom exemplo é a cromatografia de troca aniónica tolerante a sal, que permite obter as vantagens inerentes aos suportes de troca iónica (elevada versatilidade e elevadas capacidades de ligação sem comprometer a estrutura das biomoléculas), mas superando a grande desvantagem da necessidade de diluir ou diafiltrar as amostras a processar, de forma a baixar a condutividade dos meios. Está já descrito na literatura que o uso de poliaminas (aminas primárias e secundárias) como ligando, em detrimento de aminas quaternárias (ligando Q), é uma das explicações para as propriedades de tolerância ao sal devido à combinação de interações eletrostáticas com pontes de hidrogénio. A possibilidade destes ligandos em manter a adsorção de uma amostra em condições de condutividades superiores a 30mS.cm-1, faz com estes novos suportes possam ser usados tanto nos passos de captura, fazendo um processamento direto de amostras biológicas, como nos passos de polimento devido à elevada resolução obtida na separação de agregados ou formas diméricas. Contudo, o aumento da complexidade destas novas alternativas faz aumentar drasticamente a dificuldade em compreender os mecanismos de interação envolvidos no processo de adsorção. A compreensão destes mecanismos, é crucial para o desenvolvimento de futuros suportes, simulações moleculares e ainda na transposição de uma escala laboratorial para uma escala industrial. A análise dos eventos termodinâmicos dos processos de adsorção através da Microcalorimetria de Fluxo (FMC) tem vindo a provar ser uma importante ferramenta na obtenção de uma melhor compreensão das forças motrizes, dos mecanismos e das cinéticas envolvidas no processo de adsorção de biomoléculas em diferentes sistemas cromatográficos. O FMC é uma técnica em que o modo de funcionamento é muito semelhante ao de um sistema cromatográfico, mas com a particularidade de ter acoplado à coluna dois termístores que permitem medir in situ variações de energia causadas pela adsorção das biomoléculas ao suporte. Assim, recorrendo ao uso da técnica de FMC, o objetivo deste trabalho foca-se na compreensão da influência de fatores como o pH e a concentração de sal no mecanismo de adsorção da albumina bovina sérica (BSA), a suportes de cromatografia de troca aniónica tolerante a sal. A fim de complementar e interpretar os resultados obtidos por FMC, foram ainda obtidas as isotérmicas de adsorção e realizados estudos de retenção. Estes estudos foram associados com diferentes modelos teóricos, nomeadamente: a teoria de “Langmuir”, o modelo de “Stoichiometric displacement” (SD), o modelo de Yamamoto, o modelo de “Steric Mass Action” (SMA) e a análise de “Preferential interaction” (análise de Perkins). Os resultados obtidos por microcalorimetria de fluxo demonstraram que as forças motrizes do processo de adsorção em suportes tolerantes a sal são diferentes das dos suportes puramente iónicos, como o Toyopearl DEAE 650M, Toyopearl GigaCap Q-650M e TSKgel SuperQ 5PW. Nestes, como previamente demonstrado pelo nosso grupo de investigação1, revelou-se a presença de um evento endotérmico inicial relacionado com o processo de dessolvatação, seguido de um evento exotérmico associado à interação entre a proteína e o suporte. No caso do suporte tolerante a sal, na ausência e na presença de sal, observou-se sempre um único pico exotérmico a pH 8,0 e o aparecimento de dois picos exotérmicos a pH 6,0, onde o segundo pico ocorre após a amostra que contém proteína ser totalmente substituída pela solução tampão no interior da coluna. Este “timing” leva-nos a crer que existe adsorção secundária da proteína após a criação de novos locais de ligação resultantes de reorganização da mesma à superfície do suporte. A pH 8,0 não se observa este segundo evento, indicando que a adsorção inicial da proteína é forte e favorável o suficiente para não sofrer quaisquer alterações. Esta conformação preferencial a pH 8,0 pode estar relacionada a formação de pontes de hidrogénio para alem das interações electroestáticas. Apesar de o fornecedor da resina Toyopearl NH2-750F referir que o pKa do ligando é de 8,5, está bem descrito na literatura2 que o pKa de cada grupo de amina é influenciado pela sua posição no ligando e pelo tamanho da cadeia alifática. Blagbrough et al.2 refere ainda que poliaminas como a espermina (pKa=11,1) apenas a pH ligeiramente abaixo de 6,8 é que possui uma protonação completa de todas as aminas. Traspondo estes conceitos para o nosso trabalho, é plausível que a pH 6,0 todas as aminas já estejam protonadas fazendo com que as forças motrizes de adsorção sejam maioritariamente eletrostáticas enquanto que a pH 8,0, existam ainda aminas não protonadas que ficam disponíveis para estabelecer pontes de hidrogénio. Estas múltiplas interações podem requerer uma conformação preferencial da proteína-ligando impedindo posteriores reorganizações e conferindo uma elevada tolerância ao sal. Com o aumento da concentração de sal observam-se também diferenças significativas nas áreas dos picos. A pH 6,0, com o aumento da concentração de sal, verificou-se que a energia associada ao segundo evento aumenta, ao contrário do que se verifica no primeiro evento exotérmico, onde o aumento da concentração de sal provoca uma diminuição da energia libertada. O sal tem a propriedade de blindar as interações eletrostáticas e enfraquecer a interação durante o processo de adsorção, por isso, é intuitivo pensar que quanto maior a concentração de sal no meio, mais fraca será a interação inicial proteína-suporte (diminuição do primeiro pico exotérmico), possibilitando a reorganização da proteína à superfície e a formação de interações mais favoráveis (aumento do segundo evento exotérmico). Como esperado, a pH 8,0 os resultados demonstraram-se semelhantes aos observados a pH 6,0 para o primeiro evento exotérmico, observando-se a sua diminuição com o aumento da concentração de sal. A aplicação dos modelos veio suportar as explicações avançadas pela interpretação dos resultados de FMC. A pH 8,0 a BSA possui uma maior pegada à superfície do ligando (Steric mass action), fazendo com que se estabeleça um maior número de pontos de interação proteína-suporte (Stoichiometric Displacement e modelo de Yamamoto), e consequentemente uma maior remoção de moléculas de água e iões à superfície (análise de Perkins). Isto indica-nos que a proteína adota uma conformação especifica e altamente estável devido ao à formação múltiplas interações (eletrostáticas e pontes de hidrogénio), que dificulta a disrupção da adsorção por parte do sal, daí se ter observado uma maior tolerância ao sal a pH 8,0 do que a pH 6,0 (com base nas isotérmicas de adsorção, observa-se uma redução mais acentuada da capacidade máxima a pH 6,0 do que a pH 8,0 com o aumento da concentração e sal). Estes resultados também são claros quando se observa a diferença dos valores energéticos da adsorção primária, sendo claramente superiores a pH 8,0 devido ao maior número de locais de interação. Por fim, nas injeções a pH 8,0, mas perto do limite de saturação da coluna, foi observado a presença de um segundo evento exotérmico semelhante aos obtidos a pH 6,0. Estes resultados reforçam ainda mais a teoria de que a pegada da BSA à superfície é superior a pH 8,0, isto porque quando um número muito elevado de moléculas de BSA entram em contacto com o suporte, a competição pelos locais de ligação torna-se mais significativa e nem todas as moléculas conseguem adotar a posição de interação preferencial com o suporte, ficando então sujeitas a sofrer fenómenos semelhantes aos descritos a pH 6,0. Todos estes resultados confirmam que, para uma visão mais consistente dos mecanismos de adsorção, a utilização da microcalorimetria de fluxo mostra-se de grande interesse no estudo sistemático dos diferentes suportes cromatográficos. Para além disso, também a modelação associada a estudos de estrutura molecular demonstraram ser ferramentas importantes para a elucidação do complexo processo que é a adsorção de proteínas. Modelações teóricas, semi-empíricas e simulações computacionais relacionadas com o mecanismo de adsorção, especialmente de moléculas com alto peso molecular, procuram contabilizar estes eventos entalpicos sempre com o objetivo final de desenvolver não só processos cromatográficos mais rápidos, eficazes e com melhores rendimentos, como também simplificar e diminuir os custos associados à produção biotecnológica de biomoléculas com interesse farmacêutico.
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Keywords
Análise de Preferential Interaction Bsa Cromatografia Tolerante A Sal Isotérmicas de Adsorção Microcalorimetria de Fluxo Modelo de Steric Mass Action Modelo de Stoichiometric Displacement Modelo de Yamamoto