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Authors
Abstract(s)
Prostate cancer (PCa) is an androgen-sensitive neoplasia with cell survival and proliferation being dependent on androgenic regulation. At this stage, PCa cases can be treated with androgen deprivation therapy (ADT), which aims to decrease the circulating levels of androgens or block their actions. However, genetic alterations including the fusion of genes, amplification of oncogenes, gene mutations and deletions concur promoting the advance of the disease to more aggressive forms. Following this, phenotypic/behaviour changes such as loss of androgen sensitivity occur, allowing the cancer cells grow even if circulating androgens are low. It is the so-called castrate resistant prostate cancer (CRPC). A well-established observation ‘in several cancer cell types is the Warburg effect’, the metabolic reprogramming that enables cancer cells to survive, proliferate and metastasize, using high amounts of glucose as energy substrate, both in aerobic and anaerobic conditions. Tumour cells using glycolysis to maintain energy needs, subsequently produce high amounts of lactate that is exported to the extracellular medium. In the case of PCa, the metabolic reprogramming towards the more glycolytic phenotype accompanies the progression of disease to the CRPC. It was demonstrated that androgens are important regulators of PCa cells metabolism, enhancing glycolysis as well as lipid handling.
The pseudokinase family Tribbles (TRIBs), which includes TRIB1, TRIB2 and TRIB3, has been described to have a role in controlling differentiation, transcription, proliferation, and metabolism. These pseudokinase proteins are characterized by functioning as scaffold-like or adaptor molecules in many signalling pathway networks including mitogen-activated protein kinase (MAPK) and phosphoinositide 3-kinase (PI3K-AKTf) modules. Consistent with the described actions and the control of intracellular signalling, TRIBs have being involved in disease development, as well as are implicated in several cancers. Evidence indicates the oncogenic role of TRIB1 and TRIB3 and their highly expressed state in tumour initiation and progression, especially in melanoma, lung, liver, and acute leukemia, but also in PCa. Yet, the mechanisms that control TRIBs expression in PCa are still poorly understood. Moreover, the involvement of TRIB1 and TRIB3 in lipids homeostasis has been demonstrated.
The main goal of this thesis was to investigate the role of androgens in regulating TRIB1 and TRIB3 expression in PCa and to shed light on the influence of TRIBs on prostate cell fate. The androgenic modulation of TRIBs in PCa cells was determined using 10 nM 5α-dihydrotestosterone (DHT), in the presence or absence of the anti- androgen bicalutamide (10 μM). DHT treatment decreased TRIB1 and TRIB3 expression at a protein and mRNA level in the androgen sensitive LNCaP and 22Rv1 cells with no changes observed in the non-neoplastic PNT1A cells. Bicalutamide (10 μM) blocked the effect of DHT in down-regulating TRIB1 expression in LNCaP and 22Rv1 cells, which suggests the involvement of the androgen receptor (AR). These findings were validated by the expression analysis of the standard androgen- responsive gene prostate-specific antigen (PSA), confirming its increased expression in DHT treated cells and blocking of effects by bicalutamide. To further study the impact of the AR in TRIB1 regulation, we performed a knockdown (KD) of the AR in LNCaP and 22Rv1 cells and measured TRIB1 expression. AR KD resulted in a significant TRIB1 increase in 22Rv1 cells at an mRNA level. These outcomes are in line with those obtained in-vivo, as castrated mice displayed increased TRIB1 mRNA expression levels compared to control, which highlights the androgens’ regulatory effects of TRIBs in PCa. Moreover, using ChiP-seq analysis in human primary tumours vs normal solid tissues it was shown that AR directly binds to the TRIB1 and TRIB3 gene locus. LNCaP cells treated with the synthetic androgen r1881 also showed a similar pattern of TRIBs downregulation. Together these findings provide useful insight into AR actions in regulating TRIB1 expression in PCa. Concerning the physiological effects on PCa cell fate, enhanced cell viability, proliferation and migration were observed in androgen treated cells, whereas no alterations were seen on caspase-3 activity.
TRIBs associated signalling pathways targets such as pERK and pAKT, prominently known to have roles in survival, apoptosis, and differentiation in response to a range of stimuli including steroid hormones were also measured after 10 nM DHT treatment and downregulation of their expression was observed.
TRIB1 has been shown to be overexpressed in PCa and associated with the progression of disease. However, it is not clear if is the TRIB1 increased expression levels that promote the malignant transformation of prostate cells. Therefore, the influence of TRIB1 expression levels in non-neoplastic (PNT1A) and neoplastic (PC3) prostate cells fate was investigated. TRIB1 overexpression (OE) on PNT1As increased cell proliferation and migration, with no changes on caspase-3 activity and cell viability. The effect of TRIB1 OE on lipid metabolism was also measured and a significant increase of lipid droplets was observed in PNT1A cell OE TRIB1. This was accompanied by the increased expression of fatty acid synthase (FASN), a key target protein in lipid metabolism in neoplastic conditions. Overall, TRIB1 OE changed the features of non-neoplastic PNT1A cells to a cancer-like phenotype. Interestingly, no changes were observed on the viability, proliferation and metabolism of TRÎB1 knockdown PC3 cells. These results implicate TRIB1 in the regulation of metabolism, as well as suggest its role as a ‘driving force’ for tumour initiation and progression of disease in the early stages of PCa development. In summary, this dissertation demonstrated the androgen actions in the regulation of TRIBs in PCa cells. Revealing the link between TRIBs, androgens and AR in PCa development and progression. Collectively, further research on these interaction warrants TRIBs as a basis for the development of new therapeutic approaches for PCa.
O cancro da próstata (PCa) é uma neoplasia sensível aos andrógenos, sendo a sobrevivência e proliferação celular dependentes da regulação androgénica. Nesta fase, os casos de PCa podem ser tratados com terapias de privação de androgénios (ADT), as quais visam diminuir os níveis circulantes de androgénios ou bloquear as suas ações. No entanto, alterações genéticas incluindo a fusão de genes, amplificação de oncogenes, mutações e supressões de genes concorrem para promover o avanço da doença para formas mais agressivas. A seguir, ocorrem alterações fenotípicas/de comportamento, tais como a perda de sensibilidade aos androgénios, o que permite que as células cancerosas cresçam mesmo que os níveis de androgénios circulantes se mantenham baixos. É o chamado cancro da próstata resistente à castração (CRPC). Está bem estabelecido em vários tipos de células cancerosas a existência do chamado “efeito de Warburg", que consiste na reprogramação metabólica que permite às células cancerosas sobreviver, proliferar e formar metástases, utilizando elevadas quantidades de glicose como substrato energético, tanto em condições aeróbias como anaeróbias. As células tumorais utilizando glicólise para manter as necessidades energéticas, produzem subsequentemente grandes quantidades de lactato, o qual é exportado para o meio extracelular. No caso do PCa, a reprogramação metabólica para o fenótipo mais glicolítico acompanha a progressão da doença para o CRPC. Foi igualmente demonstrado que os androgénios são importantes reguladores do metabolismo das células de PCa, estimulando a glicólise, bem como o metabolismo lípidico. A família de pseudocinases Tribbles (TRIBs), que inclui a TRIB1, TRIB2 e TRIB3, foi descrita como tendo um papel no controlo da diferenciação, transcrição, proliferação e metabolismo. Estas proteínas caracterizam-se por funcionar como moléculas de tipo andaime ou adaptadoras em muitas redes de vias de sinalização, incluindo módulos de proteína cinase activada por mitógeno (MAPK) e fosfinoinositede 3- cinase (PI3K-Akt). Consistentes com as ações descritas e o controlo da sinalização intracelular, as TRIBs têm estado envolvidas no desenvolvimento de patologias diversas, bem como estão implicadas em vários cancros. As evidências indicam o papel oncogénico da TRIB1 e TRIB3 e o seu estado de elevada expressão na iniciação e progressão de tumores, especialmente no melanoma, pulmão, fígado, e leucemias agudas, mas também no PCa. No entanto, os mecanismos que controlam a expressão das TRIBs no PCa ainda são mal compreendidos. Além disso, foi demonstrado o envolvimento da TRIB1 e TRIB3 na homeostase dos lípidos. O principal objetivo desta tese é investigar o papel dos androgénios na regulação da expressão da TRIB1 e TRIB3 no PCa e lançar luz sobre a influência das TRIBs no destino das células da próstata. A modulação androgénica das TRIBs em células PCa foi determinada usando 10 nM 5α-dihidrotestosterona (DHT), na presença ou ausência do anti-androgénio bicalutamida (10 μM). O tratamento com DHT diminuiu a expressão da proteína e mRNA das TRIB1 e TRIB3 nas células de PCa sensíveis aos androgénios, LNCaP e 22Rv1, sem alterações observadas nas células não neoplásicas PNT1A. A bicalutamida (10 μM) bloqueou o efeito da DHT na supressão da expressão da TRIB1 em células LNCaP e 22Rv1, o que sugere o envolvimento do recetor de androgénios (AR). Estes resultados foram validados pela análise da expressão do gene padrão alvo dos androgénios, o antigénio específico da próstata (PSA), confirmando- se o aumento da sua expressão nas células tratadas com DHT e o bloqueio dos efeitos pela bicalutamida. Para aprofundar o estudo do impacto do AR na regulação da expressão da TRIB1, realizámos o knockdown (KD) do AR em células LNCaP e 22Rv1 e avaliámos a expressão da TRIB1. O KD do AR resultou num aumento significativo da expressão do mRNA da TRIB1 em células 22Rv1. Estes resultados estão em linha com os obtidos in vivo, uma vez que ratos castrados exibiram níveis de expressão do mRNA de TRIB1 aumentados em comparação com o controlo, o que realça os efeitos reguladores dos androgénios na expressão das TRIBs no PCa. Além disso, utilizando a análise ChiP- seq em tumores primários humanos versus tecidos sólidos normais, foi demonstrado que o AR se liga directamente ao locus dos genes TRIB1 e TRIB3. As células LNCaP tratadas com o androgénio sintético r1881 também apresentaram um padrão semelhante de regulação das TRIBs. Em conjunto, estas descobertas proporcionam uma visão útil das ações do AR na regulação da expressão da TRIB1 no PCa. Quanto aos efeitos fisiológicos sobre o destino das células de PCa, observou-se uma maior viabilidade celular, proliferação e migração nas células tratadas com androgénio, enquanto que não se observaram alterações na atividade da caspase-3. As TRIBs estão associadas a vias de sinalização e alvos moleculares como o pERK e o pAkt, conhecidos por terem papéis proeminentes na sobrevivência, apoptose, e diferenciação em resposta a uma gama de estímulos, incluindo hormonas esteróides.Foi assim também medida a sua expressão após tratamento com 10 nM DHT, sendo observada uma desregulação da sua expressão. A TRIB1 demonstrou ser sobre-expressa no PCa e associada à progressão da doença. Contudo, não é claro se os níveis de expressão aumentados da TRIB1 promovem a transformação maligna das células da próstata. Portanto, foi investigada a influência dos níveis de expressão da TRIB1 nas células da próstata não-neoplásicas (PNT1A) e neoplásicas (PC3). A sobreexpressão da TRIB1 (OE) em células PNT1As aumentou a proliferação e migração celular, sem alterações na atividade da caspase-3 e na viabilidade celular. O efeito da TRIB1 OE no metabolismo lipídico também foi medido tendo-se observado um aumento significativo de gotículas lipídicas nas célula PNT1A com OE TRIB1. Isto foi acompanhado pelo aumento da expressão da sintetase de ácidos gordos (FASN), uma proteína alvo chave no metabolismo lipídico em condições neoplásicas. Globalmente, a OE de TRIB1 mudou as características das células não neoplásicas de PNT1A para um fenótipo semelhante ao cancro. Curiosamente, não foram observadas alterações sobre a viabilidade, proliferação e metabolismo das células PC3 com silenciamento da TRIB1. Estes resultados implicam a TRIB1 na regulação do metabolismo, bem como sugerem o seu papel como "força motriz" para a iniciação de tumores e progressão da doença nas fases iniciais do desenvolvimento da PCa. Em resumo, esta dissertação demonstrou as ações androgénicas na regulação da expressão das TRIBs em células de PCa. Revelando a ligação entre as TRIBs, androgénios e AR no desenvolvimento e progressão do PCa. Coletivamente, mais investigação sobre estas interações permitirá justificar as TRIBs como base para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para a PCa.
O cancro da próstata (PCa) é uma neoplasia sensível aos andrógenos, sendo a sobrevivência e proliferação celular dependentes da regulação androgénica. Nesta fase, os casos de PCa podem ser tratados com terapias de privação de androgénios (ADT), as quais visam diminuir os níveis circulantes de androgénios ou bloquear as suas ações. No entanto, alterações genéticas incluindo a fusão de genes, amplificação de oncogenes, mutações e supressões de genes concorrem para promover o avanço da doença para formas mais agressivas. A seguir, ocorrem alterações fenotípicas/de comportamento, tais como a perda de sensibilidade aos androgénios, o que permite que as células cancerosas cresçam mesmo que os níveis de androgénios circulantes se mantenham baixos. É o chamado cancro da próstata resistente à castração (CRPC). Está bem estabelecido em vários tipos de células cancerosas a existência do chamado “efeito de Warburg", que consiste na reprogramação metabólica que permite às células cancerosas sobreviver, proliferar e formar metástases, utilizando elevadas quantidades de glicose como substrato energético, tanto em condições aeróbias como anaeróbias. As células tumorais utilizando glicólise para manter as necessidades energéticas, produzem subsequentemente grandes quantidades de lactato, o qual é exportado para o meio extracelular. No caso do PCa, a reprogramação metabólica para o fenótipo mais glicolítico acompanha a progressão da doença para o CRPC. Foi igualmente demonstrado que os androgénios são importantes reguladores do metabolismo das células de PCa, estimulando a glicólise, bem como o metabolismo lípidico. A família de pseudocinases Tribbles (TRIBs), que inclui a TRIB1, TRIB2 e TRIB3, foi descrita como tendo um papel no controlo da diferenciação, transcrição, proliferação e metabolismo. Estas proteínas caracterizam-se por funcionar como moléculas de tipo andaime ou adaptadoras em muitas redes de vias de sinalização, incluindo módulos de proteína cinase activada por mitógeno (MAPK) e fosfinoinositede 3- cinase (PI3K-Akt). Consistentes com as ações descritas e o controlo da sinalização intracelular, as TRIBs têm estado envolvidas no desenvolvimento de patologias diversas, bem como estão implicadas em vários cancros. As evidências indicam o papel oncogénico da TRIB1 e TRIB3 e o seu estado de elevada expressão na iniciação e progressão de tumores, especialmente no melanoma, pulmão, fígado, e leucemias agudas, mas também no PCa. No entanto, os mecanismos que controlam a expressão das TRIBs no PCa ainda são mal compreendidos. Além disso, foi demonstrado o envolvimento da TRIB1 e TRIB3 na homeostase dos lípidos. O principal objetivo desta tese é investigar o papel dos androgénios na regulação da expressão da TRIB1 e TRIB3 no PCa e lançar luz sobre a influência das TRIBs no destino das células da próstata. A modulação androgénica das TRIBs em células PCa foi determinada usando 10 nM 5α-dihidrotestosterona (DHT), na presença ou ausência do anti-androgénio bicalutamida (10 μM). O tratamento com DHT diminuiu a expressão da proteína e mRNA das TRIB1 e TRIB3 nas células de PCa sensíveis aos androgénios, LNCaP e 22Rv1, sem alterações observadas nas células não neoplásicas PNT1A. A bicalutamida (10 μM) bloqueou o efeito da DHT na supressão da expressão da TRIB1 em células LNCaP e 22Rv1, o que sugere o envolvimento do recetor de androgénios (AR). Estes resultados foram validados pela análise da expressão do gene padrão alvo dos androgénios, o antigénio específico da próstata (PSA), confirmando- se o aumento da sua expressão nas células tratadas com DHT e o bloqueio dos efeitos pela bicalutamida. Para aprofundar o estudo do impacto do AR na regulação da expressão da TRIB1, realizámos o knockdown (KD) do AR em células LNCaP e 22Rv1 e avaliámos a expressão da TRIB1. O KD do AR resultou num aumento significativo da expressão do mRNA da TRIB1 em células 22Rv1. Estes resultados estão em linha com os obtidos in vivo, uma vez que ratos castrados exibiram níveis de expressão do mRNA de TRIB1 aumentados em comparação com o controlo, o que realça os efeitos reguladores dos androgénios na expressão das TRIBs no PCa. Além disso, utilizando a análise ChiP- seq em tumores primários humanos versus tecidos sólidos normais, foi demonstrado que o AR se liga directamente ao locus dos genes TRIB1 e TRIB3. As células LNCaP tratadas com o androgénio sintético r1881 também apresentaram um padrão semelhante de regulação das TRIBs. Em conjunto, estas descobertas proporcionam uma visão útil das ações do AR na regulação da expressão da TRIB1 no PCa. Quanto aos efeitos fisiológicos sobre o destino das células de PCa, observou-se uma maior viabilidade celular, proliferação e migração nas células tratadas com androgénio, enquanto que não se observaram alterações na atividade da caspase-3. As TRIBs estão associadas a vias de sinalização e alvos moleculares como o pERK e o pAkt, conhecidos por terem papéis proeminentes na sobrevivência, apoptose, e diferenciação em resposta a uma gama de estímulos, incluindo hormonas esteróides.Foi assim também medida a sua expressão após tratamento com 10 nM DHT, sendo observada uma desregulação da sua expressão. A TRIB1 demonstrou ser sobre-expressa no PCa e associada à progressão da doença. Contudo, não é claro se os níveis de expressão aumentados da TRIB1 promovem a transformação maligna das células da próstata. Portanto, foi investigada a influência dos níveis de expressão da TRIB1 nas células da próstata não-neoplásicas (PNT1A) e neoplásicas (PC3). A sobreexpressão da TRIB1 (OE) em células PNT1As aumentou a proliferação e migração celular, sem alterações na atividade da caspase-3 e na viabilidade celular. O efeito da TRIB1 OE no metabolismo lipídico também foi medido tendo-se observado um aumento significativo de gotículas lipídicas nas célula PNT1A com OE TRIB1. Isto foi acompanhado pelo aumento da expressão da sintetase de ácidos gordos (FASN), uma proteína alvo chave no metabolismo lipídico em condições neoplásicas. Globalmente, a OE de TRIB1 mudou as características das células não neoplásicas de PNT1A para um fenótipo semelhante ao cancro. Curiosamente, não foram observadas alterações sobre a viabilidade, proliferação e metabolismo das células PC3 com silenciamento da TRIB1. Estes resultados implicam a TRIB1 na regulação do metabolismo, bem como sugerem o seu papel como "força motriz" para a iniciação de tumores e progressão da doença nas fases iniciais do desenvolvimento da PCa. Em resumo, esta dissertação demonstrou as ações androgénicas na regulação da expressão das TRIBs em células de PCa. Revelando a ligação entre as TRIBs, androgénios e AR no desenvolvimento e progressão do PCa. Coletivamente, mais investigação sobre estas interações permitirá justificar as TRIBs como base para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para a PCa.
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Keywords
Androgénios Tribbles Tribbles - TRIB1 Tribbles - TRIB3 Cancro da próstata Prostate cancer