Publication
New Steroidal Arylidene Derivatives Potentially Useful in the Treatment of Prostatic Diseases
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Almeida, Paulo Jorge da Silva | |
| dc.contributor.advisor | Silvestre, Samuel Martins | |
| dc.contributor.advisor | Alves, Gilberto Lourenço | |
| dc.contributor.author | Brito, Vanessa Sofia Figueiredo de | |
| dc.date.accessioned | 2023-07-20T10:14:48Z | |
| dc.date.embargo | 2025-10-10 | |
| dc.date.issued | 2023-07-04 | |
| dc.description.abstract | The prostate is a male-specific hormone-responsive gland with a crucial role in the male reproductive system and requires androgenic hormones and an androgen receptor (AR) for proper growth and development. Generally, this gland is mainly affected by three pathologies, namely prostatitis, benign prostatic hyperplasia (BPH), and malignant prostate cancer (PCa). These disorders constitute a source of significant morbidity and mortality for men worldwide. Thus, pharmacological therapy's relevance in managing these prostatic disorders is unquestionable. Currently, it is well established that the importance of steroidal hormones in the pathophysiology of BPH and PCa. In this context, it is known that the abnormally high 5α-reductase (5AR) activity in humans results in excessively high 5α-dihydrotestosterone (DHT) levels in peripheral tissues, which have been mainly implicated in the pathogenesis of BPH and PCa. Therefore, the role of DHT had contributed to the interest in finding 5AR inhibitors (5ARIs), comprising an important and commonly applied strategy principally in the treatment of BPH. Considering the unmet medical need, it is recognized that the 5ARIs clinically used, such as finasteride, exhibit low potency and several adverse side effects that significantly reduce the quality of life of patients. Furthermore, the effect of these drugs in the PCa treatment is controversial, although it seems a valid and logical approach to explore. In this context, arylidenosteroids, a class of modified steroids, have been reported with important antiproliferative activity and also with potential 5AR inhibitory activity. In the present work, the preparation of novel steroidal arylidene derivatives potentially useful in prostatic diseases, displaying inhibitory capacity against 5AR and/or antiproliferative properties against tumoral cells was intended. Essentially, this thesis aimed the discover of hit compounds for further development in the context of BPH and PCa. To achieve this goal, different synthetic strategies were exploited and new series of steroidal arylidene derivatives were obtained, and their antitumoral and 5AR inhibitory activities were evaluated. Moreover, molecular docking simulations against important targets of steroidal molecules, 5AR type 2, estrogen receptor α (ERα), AR, steroid 17α-hydroxylase/17,20 lyase (CYP17A1), and aromatase, were performed to understand the possible affinity and interactions. This thesis also contemplates the conclusion of the biological evaluation of arylidene-4-azasteroids (VB 4a-g and VB 7a-g) synthesized at the Master’s project and a comprehensive three-dimensional quantitative structure-activity relationship (3D-QSAR study considering the antiproliferative activity in prostate cells, since this work fits into the context of this thesis. In relation to this last part, robust 3D-QSAR models generated to elucidate the relation of the proliferation of LNCaP (androgen-dependent) and PC-3 (non-androgen dependent) cells and the structure of tested compounds showed the importance of the presence of bulky groups and electronegative atoms. Concerning the doctoral project, after several failed attempts to prepare new 3-,4- and 6-azasteroids modified at D-ring with fused/attached heterocycles, a new synthetic strategy was studied and applied and three distinct series of novel arylidene oxidized steroids were successfully obtained from dehydroepiandrosterone. The chemical structures and high purity of the new 16E-arylidene-5α,6α-epoxyepiandrosterone, 16E-arylidene-3β,5α,6β-trihydroxyandrosten-17-one, and 16E-arylidene-androst-4-ene-3,6,17-trione derivatives were corroborated by melting point determination, infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance spectroscopy, and high-resolution mass spectroscopy. Then, to determine their antitumoral potential, the activity of all synthesized analogs over the viability of tumoral cells was evaluated against several human tumoral and non-tumoral cell lines were assessed by (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The effect of compounds on cell proliferation was evaluated against prostate cancer androgen-dependent cells (LNCaP), prostate cancer non-androgen dependent cells (PC-3), breast cancer cell line (MCF-7), normal prostate epithelium cells (PNT1A), and normal human dermal fibroblasts (NHDF). Furthermore, preliminary studies of the mechanism of action of the most promising derivatives were performed in MCF-7, LNCaP, and PC-3 cell lines using techniques, such as immunocytochemistry, fluorescence microscopy, and caspase activity assessment. Lastly, the potential 5AR inhibitory activity of all compounds, including the arylidene-4-azasteroids synthesized during the Master’s project, were determined through testosterone quantification in mice liver microsomes by high-performance liquid chromatography coupled to a diode array detector (HPLC-DAD). This method was previously adapted, partially developed and validated, also in the context of the present project. Moreover, from the results of this assay, the main interactions of the best compounds against 5AR type 2 was also evaluated in the attempt of understanding the structure-activity relationship. Several of these new steroidal derivatives exhibited an interesting growth-inhibition effect on human tumoral cells, and generally, these tested compounds revealed to be less cytotoxic to non-tumoral cells producing higher IC50 values. The most relevant reduction of cell proliferation was observed with compounds VB 9e in MCF-7 cells (IC50= 3.47μM), VB 10e in PC-3 cells (IC50= 6.96 μM), and VB 11c in LNCaP cells (IC50= 6.48 μM). Moreover, the determined IC50 values of these compounds are very similar to the positive control, 5-fluouracil (5-FU). Additional biological studies showed that steroidal derivatives VB 9e and VB 11c seemed to trigger apoptosis in MCF-7 and LNCaP cells, respectively. VB 9e caused significant alterations in Ki67 (↓) and propidium iodide (↑) staining and modifications in nuclear morphology and cell distribution analysis in MCF-7 cells. On the other hand, VB 11c caused the same morphological and cell distribution alterations, and also seemed to increase the activity of caspase-3/7 in the LNCaP cell line. Molecular docking studies showed that these new derivatives presented stronger affinity to 5AR type 2 and CYP17A1, and poor affinity to ERα and AR. Relative to aromatase, it was verified higher affinity for steroidal 4-ene-3,6,17-triones. To finish, the effect of the steroidal arylidene derivatives on 5AR activity and the main results revealed that compound VB 11c seemed to be the most potent inhibitor (IC50= 6.12 nM). In addition, the in silico interactome study was performed and it was observed that this steroid displayed a higher number of interactions in common with finasteride, the reference, compared with other tested compounds. Interestingly, in this case, there is a correlation between in silico and experimental data. Taken together, the results showed that steroid VB 11c seemed to be the most promising molecule to be considered as a hit compound, presenting selectivity to tumoral prostate cells, potentially triggering the apoptotic cell death mechanism in the LNCaP cell line, and being the most potent against 5AR. In conclusion, the research work constitutes an important contribution to the knowledge concerning steroidal arylidene derivatives as agents with antiproliferative and 5AR inhibitory properties. Therefore, new paths were opened, showing the possibility of successfully developing potential new inhibitors based on steroid molecules for further development in the context of BPH and PCa. | pt_PT |
| dc.description.abstract | A glândula prostática humana é um órgão pertencente ao sistema reprodutor masculino, e na idade adulta, assemelha-se, tanto no tamanho como na forma, a uma castanha. A próstata é um órgão sensível a androgénios e, como tal necessita de androgénios e recetores de androgénios (RA) específicos para o normal desenvolvimento, crescimento e função. Esta glândula pode ser afetada principalmente por três condições: prostatite, hiperplasia benigna da próstata (HBP) e cancro prostático (CP). Globalmente, as duas últimas condições referidas afetam uma percentagem muito elevada de homens com idade superior a 65 anos, sendo uma das causas mais relevantes de morbilidade e mortalidade. Deste modo, a importância da terapia farmacológica na gestão destas doenças é, de facto, inquestionável. Atualmente, a relevância das hormonas esteroides na fisiopatologia da HBP e do CP é conhecida e bem suportada pelas evidências científicas. Neste contexto, sabe-se que o aumento anormal da atividade da enzima 5α-redutase (5AR) resulta na produção de uma quantidade excessiva de 5α-dihidrotestosterona (DHT), produto da conversão irreversível da testosterona por esta enzima, e que esse aumento de DHT nos tecidos periféricos tem vido a ser associado à patogénese de ambas as doenças. Consequentemente, o papel da DHT nestes cenários de doença tem contribuído para o interesse na descoberta de inibidores da 5AR, dado que é uma estratégia importante e aplicada frequentemente no tratamento da HBP. Considerando as necessidades médicas não satisfeitas neste âmbito, é reconhecido que os inibidores da 5AR utilizados na prática clínica, como a finasterida, exibem baixa potência e diversos efeitos adversos que reduzem significativamente a qualidade de vida dos utentes. No que diz respeito ao tratamento do CP, o uso destes fármacos é bastante controverso, pois apesar da finasterida parecer levar à redução da sua incidência, foi reportado pelo “Prostate Cancer Prevention Trial (PCPT)” um aumento na incidência do CP maligno em comparação com o placebo. No entanto, teoricamente é uma estratégia válida e lógica a explorar. Neste âmbito, os arilidenoesteroides constituem uma classe importante de esteroides modificados cuja atividade antiproliferativa relevante e a sua potencial capacidade de inibir a enzima 5AR tem vindo a ser reportada em diversos estudos. Neste contexto surge o principal objetivo deste trabalho, a preparação de novos arilidenos derivados de esteroides potencialmente úteis nas doenças prostáticas, apresentando capacidade inibitória da 5AR e/ou propriedades antiproliferativas em células tumorais. Globalmente, esta tese visa a descoberta de compostos “hit” para posterior desenvolvimento no contexto da HBP e CP. Para alcançar este objetivo, diversas estratégicas de síntese química foram exploradas e obteve-se com sucesso novos arilidenos derivados de esteroides. Após síntese e respetiva caracterização estrutural, as atividades antitumorais e inibitórias da 5AR destes novos derivados foram avaliadas. Além da avaliação biológica in vitro, executaram-se simulações de “docking” molecular para verificar a afinidade dos novos compostos para importantes alvos de moléculas esteroides, nomeadamente na 5AR tipo 2, no recetor de estrogénios α (REα), no RA, na 17α-hidroxilase/17,20 liase de esteroides (CYP17A1) e na aromatase. É importante referir que esta tese também contempla a realização de estudos de avaliação biológica in vitro/in silico, como estudos compreensivos de relação estrutura-atividade tridimensional (3D-REA), de arilidenos derivados de 4-azaesteroides (VB 4a-g e VB 7a-g) previamente sintetizados no contexto da dissertação de Mestrado. Este estudo de 3D-REA considerou o efeito na atividade proliferativa em células tumorais da próstata dependentes (LNCaP) e não dependentes de androgénios (PC-3), e de facto, foram gerados modelos robustos que elucidaram a relação entre a atividade e a estrutura dos compostos testados, tendo-se observado que os grupos volumosos (arilidenos) e os átomos eletronegativos são importantes para a atividade antiproliferativa in vitro. Estes resultados foram incluídos na presente tese dado que se enquadravam no tema da mesma. Relativamente ao projeto doutoral, após diversas tentativas falhadas para sintetizar novos 3-, 4- e 6-azaesteroides com heterociclos fundidos/ligados ao anel D, uma nova via sintética foi estudada e aplicada, tendo sido preparadas com sucesso três séries distintas séries de novos arilidenoesteroides oxidados a partir do esteroide desidroepiandrosterona. As estruturas químicas e o alto grau de pureza dos novos derivados de 16E-arilideno-5α,6α-epoxy-epiandrosterona, 16E-arilideno-3β,5α,6β-trihidroxi-androsten-17-ona, e 16E-arilideno-androst-4-ene-3,6,17-triona foram corroboradas pela determinação do ponto de fusão, espetroscopia de infravermelho, ressonância magnética nuclear e espetroscopia de massa de alta resolução. Seguidamente, com o intuito de determinar a potencial atividade antitumoral de todos os análogos sintetizados, a proliferação celular foi avaliada em diversas linhas humanas tumorais e não-tumorais através do ensaio colorimétrico de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Os efeitos dos compostos preparados na viabilidade celular foram estudados em células de cancro da próstata dependentes de androgénios (LNCaP), cancro da próstata não-dependentes de androgénios (PC-3), células do cancro da mama expressando REα (MCF-7), células epiteliais normais da próstata (PNT1A), e ainda em fibroblastos humanos normais da derme (NHDF). Além deste ensaio de viabilidade celular, foram realizados estudos preliminares do mecanismo de ação dos derivados mais promissores nas linhas celulares MCF-7, LNCaP, e PC-3, através do uso de técnicas como a imunocitoquímica, a microscopia de fluorescência e a avaliação da atividade das caspases. Por último, a potencial atividade inibitória da enzima 5AR de todos os derivados, incluindo os arilideno-4-azaesteroides sintetizados durante a execução do projeto de Mestrado, foi determinada através da quantificação de testosterona presente em microssomas de fígado de murganhos por cromatografia líquida de alta eficiência acoplado a um detetor de díodos (HPLC-DAD). Neste contexto, antes de aplicado, o método foi previamente adaptado, otimizado, parcialmente desenvolvido e validado de acordo com as normas estabelecidas pela Agência Europeia do Medicamento (EMA) e pela “Food and Drug Administration” (FDA). Adicionalmente, considerando os resultados obtidos, as principais interações entre os compostos mais ativos e a 5AR tipo 2 foram analisadas na tentativa de compreender a REA e de aferir quais as interações essenciais à atividade inibitória. Vários destes novos arilidenos derivados de esteroides exibiram um interessante efeito de inibição do crescimento de células tumorais, e de uma forma geral revelaram ser menos citotóxicos em células não tumorais, apresentando valores de IC50 mais elevados. A redução mais relevante da proliferação celular foi observada após tratamento com os compostos VB 9e em células MCF-7 (IC50= 3,47 μM), VB 10e em PC-3 (IC50= 6,96 μM) e VB 11c em células LNCaP (IC50= 6,48 μM). É igualmente importante referir que os valores de IC50 determinados para estes compostos é muito semelhante ao controlo positivo, 5-fluorouracilo (5-FU), um fármaco amplamente usado no tratamento de diversos tumores. Estudos biológicos complementares mostraram que os derivados esteroides VB 9e e VB 11c pareciam desencadear apoptose em células MCF-7 e LNCaP, respetivamente. O esteroide VB 9e causou alterações significativas na marcação com Ki67 (↓) e iodeto de propídio (↑) e causou modificações na morfologia nuclear e análise de distribuição celular em MCF-7. Por outro lado, o composto VB 11c causou as mesmas alterações morfológicas e na distribuição celular, e também pareceu levar ao aumento da atividade das caspases-3/7 em LNCaP. Estudos de “docking” molecular mostraram que estes novos derivados apresentam potencialmente uma forte afinidade para as macromoléculas 5AR tipo 2 e CYP17A1, e fraca afinidade para os REα e RA. Relativamente à aromatase, foi verificada uma maior afinidade para as trionas derivadas de esteroides (VB 11a-f). Para terminar, os principais resultados relativos ao estudo do efeito dos derivados de arilidenoesteroides na atividade da 5AR revelaram que o composto VB 11c pareceu ser o inibidor mais potente (IC50=6,12 nM). Além deste estudo in vitro, a análise do interactoma através de ferramentas computacionais foi efetuada e observou-se que o esteroide VB 11c apresentou um número significativo de interações em comum com a finasterida, a referência utilizada, comparando com os restantes compostos testados. Curiosamente, neste caso, verificou-se a existência de uma correlação entre dados in silico e os dados experimentais. Em conjunto, os resultados mostraram que o esteroide VB 11c parece ser a molécula mais promissora a ser considerada como composto “hit”, apresentando seletividade para células tumorais da próstata, desencadeando potencialmente o mecanismo de morte celular por apoptose em LNCaP, e sendo a molécula mais potente na inibição in vitro da enzima 5AR. Em conclusão, o trabalho de investigação aqui apresentado constitui um contributo importante para o conhecimento acerca de arilidenos derivados de esteroides como agentes com propriedades antiproliferativas e inibitórias da 5AR. Desta forma, foram aqui abertos novos caminhos para o desenvolvimento de novos inibidores baseados em moléculas esteroides com eventual interesse na HBP e no CP. | pt_PT |
| dc.description.sponsorship | Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT); Initially, this work was also supported by the grant BID/ ICI-FC/ Santander Universidades-UBI/ 2016. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 101558678 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/13391 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.relation | Novos azaesteroides modificados no anel D potencialmente úteis no tratamento do cancro e hiperplasia benigna da próstata | |
| dc.relation | Health Sciences Research Centre | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ | pt_PT |
| dc.subject | Arilidenos derivados de esteroides | pt_PT |
| dc.subject | Cancro prostático | pt_PT |
| dc.subject | Hiperplasia benigna da próstata | pt_PT |
| dc.subject | Atividade antiproliferativa | pt_PT |
| dc.subject | Docking molecular | pt_PT |
| dc.subject | Inibição da 5α-redutase | pt_PT |
| dc.title | New Steroidal Arylidene Derivatives Potentially Useful in the Treatment of Prostatic Diseases | pt_PT |
| dc.type | doctoral thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.awardTitle | Novos azaesteroides modificados no anel D potencialmente úteis no tratamento do cancro e hiperplasia benigna da próstata | |
| oaire.awardTitle | Health Sciences Research Centre | |
| oaire.awardURI | info:eu-repo/grantAgreement/FCT//SFRH%2FBD%2F131059%2F2017/PT | |
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| oaire.fundingStream | POR_CENTRO | |
| oaire.fundingStream | 6817 - DCRRNI ID | |
| person.familyName | Sofia Figueiredo de Brito | |
| person.givenName | Vanessa | |
| person.identifier.orcid | 0000-0002-8030-9379 | |
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| project.funder.name | Fundação para a Ciência e a Tecnologia | |
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| rcaap.embargofct | Contém dados temporariamente confidenciais. | pt_PT |
| rcaap.rights | embargoedAccess | pt_PT |
| rcaap.type | doctoralThesis | pt_PT |
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| thesis.degree.name | Doutoramento em Química | pt_PT |