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Authors
Abstract(s)
Resveratrol (3, 5, 4’–trans-hydroxystilbene) has been used since immemorial times in traditional medicine as an antimicrobial and antioxidant compound. Recent discoveries demonstrated other health benefits for this phytoalexin, such as anticancer and anti-ageing activities, making it desirable for the pharmaceutical, nutraceutical and cosmetic industries. This polyphenolic is a plant secondary metabolite mainly produced by peanuts and grapevines. Although plant cells were traditionally used as a biological alternative for resveratrol production, in recent years, recombinant microorganisms, such as yeast and bacteria, were proposed to improve resveratrol production. The present work describes resveratrol production in two recombinant microorganisms – Escherichia coli (E. coli) and Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) – its optimization of production in bioreactor using Design of Experiments (DoE) and the impact on cell physiology and plasmid stability, which was assessed by flow cytometry and real-time qPCR, respectively. For resveratrol quantification, a liquid-liquid extraction from culture media was performed using ethyl acetate and then a method for quantification in High Performance Liquid Chromatography – Diode Array Detector (HPLC-DAD) was validated. In order to assess which recombinant microorganism yielded higher resveratrol production, the influence of medium composition, pH, temperature, agitation, precursor concentration and optical density (OD600) at the addition of precursor were evaluated for resveratrol production in shake flask using E. coli and S. cerevisiae. The data obtained were used to create a DoE approach in order to optimize resveratrol production in bioreactor. The bioprocess was monitored using the HPLC-DAD method for resveratrol quantification, flow cytometry to assess cellular viability and real-time qPCR to evaluate plasmid segregational instability. Shake flasks screening assays revealed a 30 times higher resveratrol yield by E. coli (about 100 μg/mL) when compared to S. cerevisiae (3.17 μg/mL), which led to the choice of the first microorganism for the scale-up optimization studies. Only the factors that had the highest impact on resveratrol production were considered for the DoE approach: temperature, pH, precursor concentration and optical density (OD600) at the addition of precursor. A Central Composite Design, rotatable and full fractioned was used, which allowed the obtention of 159.96 μg/mL of resveratrol. The population of depolarized cells varied according to the conditions used, which sometimes resulted in a 10 % difference between higher and lower production assays. Plasmid segregational instability had also been observed and variations in the values of plasmid copy number (PCN) were noticed between 22 and 30 hours of fermentation, with the highest PCN values obtained at 30 hours, when also the highest amounts of resveratrol were obtained. It is possible to conclude that cellular viability and plasmid segregational instability affect significantly resveratrol production. In sum, this work outlines the optimization of resveratrol production in bioreactors using flow cytometry and real-time qPCR for bioprocess monitoring. It was demonstrated that using the appropriate tools to optimize and monitor resveratrol production process, solutions can be found for mass production of this compound, providing an effective alternative to chemical synthesis and avoiding the depletion of natural sources.
A saúde e a alimentação são assuntos que suscitam grande interesse para a população em geral. O anti-envelhecimento e a proteção contra doenças são o objeto de inúmeras investigações, muitas delas envolvendo compostos naturais produzidos por plantas. As plantas são os mais antigos medicamentos do Homem e, atualmente, alguns dos compostos por elas produzidos são usados em várias indústrias, como a cosmética e a farmacêutica. Um dos compostos que tem suscitado bastante interesse devido às suas propriedades benéficas para a saúde é o resveratrol. O resveratrol (3, 5, 4’–trans-hidroxistilbeno) é um polifenol e uma fitoalexina (metabolito secundário de plantas) pertencente à família dos estilbenos. Este composto pode ser encontrado em forma livre ou glicosilada – e ambas existem nas formas isoméricas cis e trans. cis-Resveratrol tem um máximo de absorção aos 286 nm, enquanto no isómero trans o máximo é atingido aos 306 nm. Esta fitoalexina não-flavonóide é produzida em plantas como resposta ao stress biótico (infeções por fungos ou bactérias) e abiótico, como radiação UV, calor ou lesão. Está presente em várias famílias de plantas e em pelo menos 72 espécies, mas encontra-se sobretudo nas uvas e amendoins. É encontrado frequentemente nos vinhos tintos, que pela ação antioxidante do resveratrol, são muitas vezes reconhecidos como cardioprotectores. O resveratrol reduz a morte celular e a sua atividade anti-inflamatória leva ao decréscimo das espécies reativas de oxigénio, sendo por isso eficaz no combate ao stress oxidativo, protegendo os componentes celulares. Este composto polifenólico demonstra ainda benefícios noutras áreas, agindo como agente antimicrobiano. O resveratrol possui também propriedades anticarcinogénicas; porém, a sua ação mais conhecida é provavelmente a ação anti-envelhecimento. Ainda há poucos dados sobre o metabolismo de resveratrol nos humanos, mas os últimos estudos em animais indicam que o resveratrol é facilmente absorvido após toma oral sobretudo no intestino delgado. No entanto, ainda é necessário mais informação sobre as doses e correlações com os efeitos. Numa tentativa de criar formas alternativas à síntese química de resveratrol, alguns bioprocessos têm sido desenvolvidos para a sua produção em células de plantas e microrganismos recombinantes. Atualmente, o resveratrol pode ser produzido através de culturas de células vegetais, que têm a vantagem de serem totipotentes. Um dos sistemas de produção é a cultura de células suspensas, um sistema com boa reprodutibilidade e que não necessita de modificações genéticas. O máximo produzido por esta técnica foi 280 mg/L; porém, adicionando elicitores à cultura, pode atingir-se 5027 mg/L. Outra alternativa é a cultura de raízes e também a cultura de calos, ambas de rápido crescimento e bioquimicamente estáveis, mas com rendimentos relativamente baixos (1.5 mg/g DW e 33 mg/g, respetivamente). Desta forma, tendo como objectivo a produção de maiores quantidades, recorre-se aos microrganismos recombinantes, sendo os mais estudados a bactéria Escherichia coli (E. coli) e a levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Tendo fácil manipulação e sendo largamente estudada, a bactéria E. coli foi o microrganismo que até à data produziu a maior quantidade de resveratrol de forma recombinante (1380 mg/L), enquanto a S. cerevisiae, que cresce rapidamente e é um organismo eucariota, produz menores quantidades de resveratrol: o seu máximo foi 391 mg/L. Desta forma, a E. coli é preferida como sistema recombinante para a produção de resveratrol. Embora o máximo produzido tenha sido atingido em culturas de células suspensas, os organismos recombinantes são geralmente preferidos devido à fácil manipulação e baixos custos associados. Os microrganismos recombinantes E. coli e S. cerevisiae são cultivados, numa fase inicial, em balão, sendo importante a definição das condições de cultura como a temperatura, pH e agitação, assim como a composição dos meio de cultura, que deve ir de encontro aos requisitos nutricionais dos microrganismos em questão. No entanto, para obter um maior rendimento e controlo, este processo pode ser efetuado em bioreator. Por vezes, numa tentativa de otimizar as condições de cultura, testam-se vários fatores, um a um, até definir quais os pontos que mais favorecem a produção. Esta abordagem pode posteriormente ser aproveitada para fazer um desenho experimental (como o Central Composite Rotatable Design), no qual se conjugam vários fatores para determinar quais são os mais relevantes e influentes na produção do composto de interesse. A resposta do modelo gerado é submetida a uma análise estatística, obtendo-se uma resposta de superfície, que quantifica a relação entre os fatores a testar e as respostas obtidas. Muitas vezes são usados métodos de monitorização paralelamente aos ensaios de produção. Neste caso, para avaliar a viabilidade celular e a instabilidade segregacional dos plasmídeos é usada a citometria de fluxo e real-time qPCR, respetivamente. Estes dois parâmetros são muito importantes no processo, uma vez que baixo crescimento celular ou células metabolicamente pouco ativas, assim como uma partição incorreta de plasmídeos para as células filhas podem levar a uma grande diminuição na produtividade final. A citometria de fluxo fornece em tempo real informação sobre a viabilidade celular, atividade enzimática ou conteúdo em ácidos nucleicos. É muitas vezes necessário recorrer a fluoróforos, como o BOX bis-(1,3-ácidodibutilbarbitúrico)trimetina oxonol, que avalia o potencial de membrana (se está ou não despolarizada), ou o iodeto de propídeo (PI), que avalia a permeabilidade da membrana. Estes dois compostos foram usados neste estudo para averiguar, através de citometria de fluxo, a viabilidade celular de fermentações em bioreator. Outro ponto que é necessário avaliar é a estabilidade segregacional dos plasmídeos, que é verificada usando real-time qPCR através da monitorização do número de cópias de plasmídeo (PCN). Esta técnica permite uma rápida quantificação de qualquer sequência alvo num curto espaço de tempo. Desta forma, avaliando-se parâmetros adicionais à fermentação, pretende-se maximizar a produção de resveratrol. Devido ao elevado número de aplicações e também à elevada procura das indústrias por este composto, o objetivo geral deste estudo é produzir resveratrol em bioreatores usando microrganismos recombinantes (E. coli e S. cerevisiae), ao mesmo tempo que se monitoriza o processo para verificar a fisiologia celular (através de citometria de fluxo) e a instabilidade segregacional, medindo o número de cópias de plasmídeo através de real-time qPCR. Embora a levedura S. cerevisiae não tenha sofrido transformação, a bactéria E. coli BW27784 foi transformada com os plasmídeos pAC-4CL1 e pUC-STS. Para analisar as quantidades de composto produzidas em fermentações, são geralmente usados métodos cromatográficos (cromatografia líquida ou gasosa) após as amostras terem sido submetidas a extração. De forma a quantificar o resveratrol nas amostras de meio de cultura, o método cromatográfico foi validado segundo regras internacionais. A extração de resveratrol foi efetuada usando uma extração líquido-líquido com acetato de etilo, sendo as amostras posteriormente injetadas num aparelho de cromatografia líquida de altíssima performance (HPLC) acoplado a um detetor de diode array (DAD). Foi usada uma coluna Zorbax C-18 a 25 ºC, tendo como fase móvel água, acetonitrilo e ácido acético nas proporções 66:33:0.1, a pH 3.4 e a um caudal de 1 mL/min. A curva de calibração foi feita com 7 pontos entre a concentração de 0.1 a 10 µg/mL, tendo-se obtido uma correlação superior a 0.99 usando uma ponderação estatística de . A eficiência de extração foi de aproximadamente 100 % para os valores 0.1 e 10 µg/mL e o máximo desvio padrão obtido em todas as análises foi ± 0.41. Concluiu-se deste modo que, como os valores se encontravam dentro dos parâmetros definidos internacionalmente, o método é reprodutível, preciso e rigoroso, devido à pequena variação entre os valores analisados e obtidos. O método também é reprodutível devido ao baixo erro associado à precisão intradia (cujo valor máximo de desvio padrão foi de ± 0.22, podendo ser utilizado para a quantificação de resveratrol neste tipo de amostras. De seguida, foram efetuados ensaios de screening para avaliar qual o microrganismo recombinante que permitia a obtenção de maiores níveis de produção de resveratrol. Para estes ensaios foram usados os dois microrganismos recombinantes em estudo, tendo sido avaliados vários parâmetros que poderiam influenciar a produção de resveratrol: temperatura, composição do meio, densidade ótica (OD600) na altura da indução, concentração de indutor (ácido p-cumárico), agitação e, para a bactéria, foi também avaliada a influência do pH. No ensaio das concentrações de indutor, foram avaliadas 6 concentrações: 0, 1 ou 2, 5, 10, 15 e 20 mM. A produção máxima de resveratrol em E. coli foi atingida com 10 Mm de indutor, obtendo-se 105.65 µg/mL de resveratrol; enquanto 5 mM foi a concentração de indutor que levou a uma maior produção em S. cerevisiae; no entanto, devido ao caráter tóxico do solvente usado para preparar o indutor (DMSO), tanto a E. coli como a S. cerevisiae deixaram praticamente de crescer e produzir acima de 10 Mm. Quanto à densidade ótica na altura da indução, verificou-se que, em E. coli, a indução a densidades óticas inferiores a 0.2 tinha um impacto negativo na produção. Na levedura, este ensaio não demonstrou ter impacto na produção, embora o melhor resultado se tenha obtido a uma densidade de 1. No estudo da influência da temperatura na produção de resveratrol, foram feitos ensaios a 25 ºC, 30 ºC, 37 ºC e 42 ºC, tendo sido verificado que a temperatura que permite a obtenção de concentrações mais elevadas de resveratrol é 30 ºC para ambos os microrganismos, onde se atingiu a produção máxima (83.10 µg/mL para a E. coli e 1.23 µg/mL para a S. cerevisiae). A influência da agitação na produção de resveratrol também foi avaliada (150, 200, 250 e 300 rpm) e concluiu-se que a agitação ótima para os dois microrganismos é diferente, sendo que para a E. coli é 250 rpm e para a S. cerevisiae é 200 rpm. No entanto, a agitação é um fator sem grande impacto na produção final, pois não existe grande variação nos valores da produção tendo em conta a mudança na agitação. Nos ensaios com diferentes composições do meio de cultura, foi testada a influência do tipo de fontes de carbono e azoto, tendo-se verificado que ambos os microrganismos utilizaram as maiores quantidades de nutrientes em detrimento da produção de resveratrol, que apesar das elevadas densidades óticas atingidas, apenas ficou próxima aos 100 µg/mL. Como nos ensaios anteriores a S. cerevisiae produziu sempre menores concentrações de resveratrol que a E. coli, esta foi seleccionada para os ensaios subsequentes. Desta forma, os estudos sobre o pH incidiram apenas neste microrganismo, e no ensaio realizado para o estudo da influência do pH na produção de resveratrol, verificou-se que o ponto óptimo de produção foi atingido a pH 7. Após realização dos ensaios preliminares, os resultados foram usados para criar uma grelha de ensaios de design experimental (Design of Experiments, DoE). Uma vez que nem todos os fatores testados influenciaram de igual forma a produção de resveratrol em balão, para o desenho experimental foram apenas considerados os fatores temperatura, pH, concentração de indutor e a densidade ótica na altura da indução. Apesar de, estatisticamente, o modelo não ter sido validado, foi possível retirar conclusões acerca da produção de resveratrol nesta estirpe recombinante de E. coli. O máximo de produção obtido foi de 159.96 µg/mL, a maior concentração descrita até ao momento para esta estirpe. As condições para obtenção deste valor foram 4 mM de ácido p-cumárico adicionado à densidade ótica de 0.8, sendo o pH de 6.5 e a temperatura de 28 ºC. Este estudo revelou também que, embora haja fatores que influenciam grandemente a produção de resveratrol e crescimento bacteriano (como a temperatura e pH), verificou-se que a influência e interação com outros fatores têm um peso importante no resultado final, pois obtiveram-se concentrações elevadas de resveratrol quando alguns dos fatores do ensaio estavam mais distantes do ideal. Quanto aos resultados de fisiologia celular, pode concluir-se que cerca de 26 % das células se encontravam despolarizadas e 4 % estavam mortas no final de 30 horas de fermentação. Os elevados valores de células despolarizadas podem ser devido à falta de nutrientes no meio, que levou à quebra das funções básicas de manutenção nas células, como a manutenção do potencial de membrana. No entanto, elevadas concentrações de DMSO no indutor mostraram ter um efeito adverso na viabilidade celular. Quanto à análise da instabilidade segregacional, pode concluir-se que o PCN aumenta em ambos os plasmídeos das 22 às 30 horas, como se pode verificar no ensaio 8, em que os valores para as 22 e 30 horas oscilaram entre os 215 e os 1541 para o pAC-4CL e os 72 e 89 para o pUC-STS. Esta pode ser uma explicação para a produção mais elevada de resveratrol obtida às 30 horas de fermentação. Concluiu-se também que o plasmídeo pUC-STS é mais instável, pois as temperaturas usadas não favoreceram a sua indução, além de que contém um gene de resistência à ampicilina que favorece o aumento da instabilidade segregacional. No geral, os valores de PCN são mais baixos relativamente a outros estudos devido à carga metabólica imposta pelos plasmídeos, o que resulta em menores taxas de crescimento e aumenta a instabilidade segregacional. Em suma, neste estudo foi possível a produção de elevadas quantidades de resveratrol em bioreator a partir de microrganismos recombinantes e recorrendo a ferramentas adequadas de monitorização. Este estudo pode ser um possível ponto de partida para a produção industrial deste composto e uma alternativa viável em relação à síntese química e ao consumo dos recursos naturais.
A saúde e a alimentação são assuntos que suscitam grande interesse para a população em geral. O anti-envelhecimento e a proteção contra doenças são o objeto de inúmeras investigações, muitas delas envolvendo compostos naturais produzidos por plantas. As plantas são os mais antigos medicamentos do Homem e, atualmente, alguns dos compostos por elas produzidos são usados em várias indústrias, como a cosmética e a farmacêutica. Um dos compostos que tem suscitado bastante interesse devido às suas propriedades benéficas para a saúde é o resveratrol. O resveratrol (3, 5, 4’–trans-hidroxistilbeno) é um polifenol e uma fitoalexina (metabolito secundário de plantas) pertencente à família dos estilbenos. Este composto pode ser encontrado em forma livre ou glicosilada – e ambas existem nas formas isoméricas cis e trans. cis-Resveratrol tem um máximo de absorção aos 286 nm, enquanto no isómero trans o máximo é atingido aos 306 nm. Esta fitoalexina não-flavonóide é produzida em plantas como resposta ao stress biótico (infeções por fungos ou bactérias) e abiótico, como radiação UV, calor ou lesão. Está presente em várias famílias de plantas e em pelo menos 72 espécies, mas encontra-se sobretudo nas uvas e amendoins. É encontrado frequentemente nos vinhos tintos, que pela ação antioxidante do resveratrol, são muitas vezes reconhecidos como cardioprotectores. O resveratrol reduz a morte celular e a sua atividade anti-inflamatória leva ao decréscimo das espécies reativas de oxigénio, sendo por isso eficaz no combate ao stress oxidativo, protegendo os componentes celulares. Este composto polifenólico demonstra ainda benefícios noutras áreas, agindo como agente antimicrobiano. O resveratrol possui também propriedades anticarcinogénicas; porém, a sua ação mais conhecida é provavelmente a ação anti-envelhecimento. Ainda há poucos dados sobre o metabolismo de resveratrol nos humanos, mas os últimos estudos em animais indicam que o resveratrol é facilmente absorvido após toma oral sobretudo no intestino delgado. No entanto, ainda é necessário mais informação sobre as doses e correlações com os efeitos. Numa tentativa de criar formas alternativas à síntese química de resveratrol, alguns bioprocessos têm sido desenvolvidos para a sua produção em células de plantas e microrganismos recombinantes. Atualmente, o resveratrol pode ser produzido através de culturas de células vegetais, que têm a vantagem de serem totipotentes. Um dos sistemas de produção é a cultura de células suspensas, um sistema com boa reprodutibilidade e que não necessita de modificações genéticas. O máximo produzido por esta técnica foi 280 mg/L; porém, adicionando elicitores à cultura, pode atingir-se 5027 mg/L. Outra alternativa é a cultura de raízes e também a cultura de calos, ambas de rápido crescimento e bioquimicamente estáveis, mas com rendimentos relativamente baixos (1.5 mg/g DW e 33 mg/g, respetivamente). Desta forma, tendo como objectivo a produção de maiores quantidades, recorre-se aos microrganismos recombinantes, sendo os mais estudados a bactéria Escherichia coli (E. coli) e a levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Tendo fácil manipulação e sendo largamente estudada, a bactéria E. coli foi o microrganismo que até à data produziu a maior quantidade de resveratrol de forma recombinante (1380 mg/L), enquanto a S. cerevisiae, que cresce rapidamente e é um organismo eucariota, produz menores quantidades de resveratrol: o seu máximo foi 391 mg/L. Desta forma, a E. coli é preferida como sistema recombinante para a produção de resveratrol. Embora o máximo produzido tenha sido atingido em culturas de células suspensas, os organismos recombinantes são geralmente preferidos devido à fácil manipulação e baixos custos associados. Os microrganismos recombinantes E. coli e S. cerevisiae são cultivados, numa fase inicial, em balão, sendo importante a definição das condições de cultura como a temperatura, pH e agitação, assim como a composição dos meio de cultura, que deve ir de encontro aos requisitos nutricionais dos microrganismos em questão. No entanto, para obter um maior rendimento e controlo, este processo pode ser efetuado em bioreator. Por vezes, numa tentativa de otimizar as condições de cultura, testam-se vários fatores, um a um, até definir quais os pontos que mais favorecem a produção. Esta abordagem pode posteriormente ser aproveitada para fazer um desenho experimental (como o Central Composite Rotatable Design), no qual se conjugam vários fatores para determinar quais são os mais relevantes e influentes na produção do composto de interesse. A resposta do modelo gerado é submetida a uma análise estatística, obtendo-se uma resposta de superfície, que quantifica a relação entre os fatores a testar e as respostas obtidas. Muitas vezes são usados métodos de monitorização paralelamente aos ensaios de produção. Neste caso, para avaliar a viabilidade celular e a instabilidade segregacional dos plasmídeos é usada a citometria de fluxo e real-time qPCR, respetivamente. Estes dois parâmetros são muito importantes no processo, uma vez que baixo crescimento celular ou células metabolicamente pouco ativas, assim como uma partição incorreta de plasmídeos para as células filhas podem levar a uma grande diminuição na produtividade final. A citometria de fluxo fornece em tempo real informação sobre a viabilidade celular, atividade enzimática ou conteúdo em ácidos nucleicos. É muitas vezes necessário recorrer a fluoróforos, como o BOX bis-(1,3-ácidodibutilbarbitúrico)trimetina oxonol, que avalia o potencial de membrana (se está ou não despolarizada), ou o iodeto de propídeo (PI), que avalia a permeabilidade da membrana. Estes dois compostos foram usados neste estudo para averiguar, através de citometria de fluxo, a viabilidade celular de fermentações em bioreator. Outro ponto que é necessário avaliar é a estabilidade segregacional dos plasmídeos, que é verificada usando real-time qPCR através da monitorização do número de cópias de plasmídeo (PCN). Esta técnica permite uma rápida quantificação de qualquer sequência alvo num curto espaço de tempo. Desta forma, avaliando-se parâmetros adicionais à fermentação, pretende-se maximizar a produção de resveratrol. Devido ao elevado número de aplicações e também à elevada procura das indústrias por este composto, o objetivo geral deste estudo é produzir resveratrol em bioreatores usando microrganismos recombinantes (E. coli e S. cerevisiae), ao mesmo tempo que se monitoriza o processo para verificar a fisiologia celular (através de citometria de fluxo) e a instabilidade segregacional, medindo o número de cópias de plasmídeo através de real-time qPCR. Embora a levedura S. cerevisiae não tenha sofrido transformação, a bactéria E. coli BW27784 foi transformada com os plasmídeos pAC-4CL1 e pUC-STS. Para analisar as quantidades de composto produzidas em fermentações, são geralmente usados métodos cromatográficos (cromatografia líquida ou gasosa) após as amostras terem sido submetidas a extração. De forma a quantificar o resveratrol nas amostras de meio de cultura, o método cromatográfico foi validado segundo regras internacionais. A extração de resveratrol foi efetuada usando uma extração líquido-líquido com acetato de etilo, sendo as amostras posteriormente injetadas num aparelho de cromatografia líquida de altíssima performance (HPLC) acoplado a um detetor de diode array (DAD). Foi usada uma coluna Zorbax C-18 a 25 ºC, tendo como fase móvel água, acetonitrilo e ácido acético nas proporções 66:33:0.1, a pH 3.4 e a um caudal de 1 mL/min. A curva de calibração foi feita com 7 pontos entre a concentração de 0.1 a 10 µg/mL, tendo-se obtido uma correlação superior a 0.99 usando uma ponderação estatística de . A eficiência de extração foi de aproximadamente 100 % para os valores 0.1 e 10 µg/mL e o máximo desvio padrão obtido em todas as análises foi ± 0.41. Concluiu-se deste modo que, como os valores se encontravam dentro dos parâmetros definidos internacionalmente, o método é reprodutível, preciso e rigoroso, devido à pequena variação entre os valores analisados e obtidos. O método também é reprodutível devido ao baixo erro associado à precisão intradia (cujo valor máximo de desvio padrão foi de ± 0.22, podendo ser utilizado para a quantificação de resveratrol neste tipo de amostras. De seguida, foram efetuados ensaios de screening para avaliar qual o microrganismo recombinante que permitia a obtenção de maiores níveis de produção de resveratrol. Para estes ensaios foram usados os dois microrganismos recombinantes em estudo, tendo sido avaliados vários parâmetros que poderiam influenciar a produção de resveratrol: temperatura, composição do meio, densidade ótica (OD600) na altura da indução, concentração de indutor (ácido p-cumárico), agitação e, para a bactéria, foi também avaliada a influência do pH. No ensaio das concentrações de indutor, foram avaliadas 6 concentrações: 0, 1 ou 2, 5, 10, 15 e 20 mM. A produção máxima de resveratrol em E. coli foi atingida com 10 Mm de indutor, obtendo-se 105.65 µg/mL de resveratrol; enquanto 5 mM foi a concentração de indutor que levou a uma maior produção em S. cerevisiae; no entanto, devido ao caráter tóxico do solvente usado para preparar o indutor (DMSO), tanto a E. coli como a S. cerevisiae deixaram praticamente de crescer e produzir acima de 10 Mm. Quanto à densidade ótica na altura da indução, verificou-se que, em E. coli, a indução a densidades óticas inferiores a 0.2 tinha um impacto negativo na produção. Na levedura, este ensaio não demonstrou ter impacto na produção, embora o melhor resultado se tenha obtido a uma densidade de 1. No estudo da influência da temperatura na produção de resveratrol, foram feitos ensaios a 25 ºC, 30 ºC, 37 ºC e 42 ºC, tendo sido verificado que a temperatura que permite a obtenção de concentrações mais elevadas de resveratrol é 30 ºC para ambos os microrganismos, onde se atingiu a produção máxima (83.10 µg/mL para a E. coli e 1.23 µg/mL para a S. cerevisiae). A influência da agitação na produção de resveratrol também foi avaliada (150, 200, 250 e 300 rpm) e concluiu-se que a agitação ótima para os dois microrganismos é diferente, sendo que para a E. coli é 250 rpm e para a S. cerevisiae é 200 rpm. No entanto, a agitação é um fator sem grande impacto na produção final, pois não existe grande variação nos valores da produção tendo em conta a mudança na agitação. Nos ensaios com diferentes composições do meio de cultura, foi testada a influência do tipo de fontes de carbono e azoto, tendo-se verificado que ambos os microrganismos utilizaram as maiores quantidades de nutrientes em detrimento da produção de resveratrol, que apesar das elevadas densidades óticas atingidas, apenas ficou próxima aos 100 µg/mL. Como nos ensaios anteriores a S. cerevisiae produziu sempre menores concentrações de resveratrol que a E. coli, esta foi seleccionada para os ensaios subsequentes. Desta forma, os estudos sobre o pH incidiram apenas neste microrganismo, e no ensaio realizado para o estudo da influência do pH na produção de resveratrol, verificou-se que o ponto óptimo de produção foi atingido a pH 7. Após realização dos ensaios preliminares, os resultados foram usados para criar uma grelha de ensaios de design experimental (Design of Experiments, DoE). Uma vez que nem todos os fatores testados influenciaram de igual forma a produção de resveratrol em balão, para o desenho experimental foram apenas considerados os fatores temperatura, pH, concentração de indutor e a densidade ótica na altura da indução. Apesar de, estatisticamente, o modelo não ter sido validado, foi possível retirar conclusões acerca da produção de resveratrol nesta estirpe recombinante de E. coli. O máximo de produção obtido foi de 159.96 µg/mL, a maior concentração descrita até ao momento para esta estirpe. As condições para obtenção deste valor foram 4 mM de ácido p-cumárico adicionado à densidade ótica de 0.8, sendo o pH de 6.5 e a temperatura de 28 ºC. Este estudo revelou também que, embora haja fatores que influenciam grandemente a produção de resveratrol e crescimento bacteriano (como a temperatura e pH), verificou-se que a influência e interação com outros fatores têm um peso importante no resultado final, pois obtiveram-se concentrações elevadas de resveratrol quando alguns dos fatores do ensaio estavam mais distantes do ideal. Quanto aos resultados de fisiologia celular, pode concluir-se que cerca de 26 % das células se encontravam despolarizadas e 4 % estavam mortas no final de 30 horas de fermentação. Os elevados valores de células despolarizadas podem ser devido à falta de nutrientes no meio, que levou à quebra das funções básicas de manutenção nas células, como a manutenção do potencial de membrana. No entanto, elevadas concentrações de DMSO no indutor mostraram ter um efeito adverso na viabilidade celular. Quanto à análise da instabilidade segregacional, pode concluir-se que o PCN aumenta em ambos os plasmídeos das 22 às 30 horas, como se pode verificar no ensaio 8, em que os valores para as 22 e 30 horas oscilaram entre os 215 e os 1541 para o pAC-4CL e os 72 e 89 para o pUC-STS. Esta pode ser uma explicação para a produção mais elevada de resveratrol obtida às 30 horas de fermentação. Concluiu-se também que o plasmídeo pUC-STS é mais instável, pois as temperaturas usadas não favoreceram a sua indução, além de que contém um gene de resistência à ampicilina que favorece o aumento da instabilidade segregacional. No geral, os valores de PCN são mais baixos relativamente a outros estudos devido à carga metabólica imposta pelos plasmídeos, o que resulta em menores taxas de crescimento e aumenta a instabilidade segregacional. Em suma, neste estudo foi possível a produção de elevadas quantidades de resveratrol em bioreator a partir de microrganismos recombinantes e recorrendo a ferramentas adequadas de monitorização. Este estudo pode ser um possível ponto de partida para a produção industrial deste composto e uma alternativa viável em relação à síntese química e ao consumo dos recursos naturais.
Description
Keywords
HPLC.DAD (High Performance Liquid Chromatograph-Diode Array Detector) DOE (Design of Experiments) Real-time qPCR qPCR (Quantitative polymerase chair reaction)