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Abstract(s)
G-quadruplexes (G4s) are non-canonical four-stranded nucleic acid secondary structures that can form in guanine-rich regions in the human genome and transcriptome. DNAs G4s are found in critical regulatory regions of the human genome such as the end of telomers and the promoter regions of several oncogenes. These structures have been implicated in the control of key cellular events including replication, transcription, genome stability, and epigenetic regulation. On the other hand, RNAs G4 are found within non-coding regions and are implicated in crucial RNA metabolism events, including the regulation of RNA processing and translation. Due to their biological relevance and structural features, G4s are considered suitable therapeutic targets. The prevalence of G4 folding in the cancer context and its stabilization can be used as an anti-tumor treatment strategy in different cancer types.
Several synthetic small molecules with high specificity for G4s DNAs and RNAs relative to double-stranded DNA (G4 ligands) have been developed and evaluated for their therapeutic potential. Over the years, thousands of small molecules have been reported as G4 ligands with in vitro and/or in vivo anti-tumor activity. Often, but not always, G4 ligands have a planar aromatic core for π-π stacking with G-quartet and a positively charged or basic group(s) to interact with the phosphate backbone of nucleic acid. Different scaffolds containing these chemical features, such as quindolines, acridines, naphthalene diimides, and phenanthrolines have proved to have G4 binding properties and anti-tumor activities. These small organic molecules interacting with G4s may affect cancer cell growth in different ways, including inhibition of telomerase or interference with telomere function, modulation of oncogenes expression by stabilizing G4 in their promoter and regulating microRNA biogenesis (miRNAs) by stabilizing G4 in microRNA precursors (pre-miRNAs).
Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer-related death worldwide and is divided into two major subtypes, small-cell lung cancer (SCLC), and non-small cell lung cancer (NSCLC). Although therapeutic options such as surgery and chemoradiotherapy prove efficacy in the early stage of the disease, their effectiveness is limited in advanced LC where most patients are diagnosed. Although immune checkpoint inhibitors have shown promising clinical outcomes, the high level of molecular heterogeneity in LC makes treatment difficult and new therapeutic strategies are needed. The prevalence of G4 formation in important regulatory systems in LC including proto-oncogenes (e.g. MYC, BCL-2, KRAS, KIT, and VEGF) and telomere regions make then attractive targets. Similarly to other cancer types, G4 ligand-induced stabilization promotes changes in telomere maintenance and decreases oncogene expression levels. Ongoing efforts have been made to harness G4 ligands for inducing G4 stabilization in the LC context. Different classes of G4s ligands may lead to in vitro antiproliferative activity and, in some cases, in vivo anti-tumor effects.
Overall, this thesis aims to develop novel G4 ligands derivatived from 1,10-phenanthroline, which can bind/stabilize G4 structures present in important regulatory regions in LC acting as anti-tumor agents.
The chemical synthesis and screening of heterocyclic compounds featuring phenyl, quinoline, naphthalene, acridines, and phenanthroline scaffolds were assessed to explore their stabilization effect towards G4 structures in c-MYC, KRAS and VEGF promoters, human telomeric motif, and pre-MIR150 RNA G4. The acridine moiety exhibited the highest G4 stabilization, followed by phenanthroline. Additionally, most compounds proved greater anti-tumor efficacy in LC cells than in non-malignant cells.
Subsequently, a novel class of phenanthroline derivatives was synthesized and structurally characterized. In addition, to assess their potential to bind/stabilize G4-forming sequences, several biophysical techniques, including förster resonance energy transfer (FRET) melting assay, circular dichroism (CD) studies and fluorescence titrations were employed. The in vitro anti-tumor activity of these compounds has been evaluated against LC cell lines via MTT assay.
Sixteen derivatives of 1,10-phenanthroline were synthesized, featuring substituents at positions 2 and 9 with either amine or amide side chains, by direct condensation reactions. Among these derivatives, those bearing methoxyaniline and ethane-diaminium side chains have been shown to stabilize various G4 topologies derived from human telomere sequences. These included hybrid, parallel, and antiparallel G4 structures, with a marked preference for the hybrid topology of the F21T sequence (ΔTm =7.2 – 12 °C, by FRET melting). Additionally, the ligands displayed promising cytotoxic profiles and exhibited greater efficacy against A549 than H1299 LC cells. Additionally, novel ten 1,10-phenanthroline-2,9-bistriazoles derivatives were synthesized via cooper catalyze azide/alkyne cycloaddition reactions. Through biophysical assessment, three promising G4 ligands against KRAS G4 sequences were identified, exhibiting increases in melting temperature (ΔTm =4.7 – 11.2 °C, by FRET melting) and binding affinities ranging between 10-6 and 10-9 M. Evaluation of anti-tumor activity revealed that the compound bearing a phenyl ring linked to the triazole moiety exhibited a potent inhibitory effect on A549 and H1299 cancer cell growth (IC50 = 14.6 and 10.9 μM, respectively). Overall, the experimental results demonstrated that the synthesized compounds have the potential to bind/stabilize different G4-forming sequences and may serve as promising scaffolds for the development of G4 ligands. Additionally, this study provides invaluable insights into the structure-activity relationships for this class of compounds to maximize their activity.
Finally, to the best of our knowledge, we have identified, for the first time, a G4-forming region within the human precursor of MIR150 (pre-MIR150). The G4-forming region folds into a parallel RNA G4 and has the potential to interact with nucleolin (NCL), which is a protein overexpressed on the cell surface of cancer cells involved in several cellular processes, including tumorigenesis, angiogenesis, and signaling pathways. The thermal stability of G4 increases in the presence of a commercial phenanthroline ligand (PhenDC3), and the formation of ternary complex G4/PhenDC3/NCL was observed. Moreover, the G4 structure in pre-MIR150 recognized NCL-positive LC cancer cells, and liquid biopsies when fluorescently labeled, can be used as a probe.
Os G-quadruplexes (G4s) são estruturas secundárias não-canónicas de ácidos nucleícos que se podem formar em regiões ricas em guanina no genoma e transcriptoma humanos. Os G4s de DNA são encontrados em regiões regulatórias importantes, como no final dos telómeros e nas regiões promotoras de vários oncogenes. Estas estruturas estão envolvidas no controlo de inúmeros processos celulares, incluindo na replicação, transcrição, estabilidade do genoma, e regulação epigenética. Por outro lado, os G4s de RNA são encontrados em regiões não codificantes estando envolvidos em processos essenciais do metabolismo do RNA, incluindo na regulação do processamento de RNA e na tradução. Devido à sua relevância biológica e características estruturais, os G4s são considerados alvos terapêuticos relevantes. A formação e estabilização de estruturas de G4, no contexto oncológico, pode ser utilizada como estratégia anti-tumoral. Várias moléculas de baixo peso molecular com elevada especificidade para G4s de DNA e RNA (ligandos de G4) foram desenvolvidas e avaliadas quanto ao seu potencial terapêutico. Ao longo dos últimos anos, inúmeros ligandos de G4 evidenciaram atividade anti-tumoral in vitro e/ou in vivo. Frequentemente, mas nem sempre, os ligandos de G4 possuem um núcleo aromático planar que permite o empilhamento π-π com o quarteto de guanina, e grupo(s) básico(s) ou carregado(s) positivamente para interação com o grupo fosfato do ácido nucleico. Diferentes compostos com estas características químicas, como quinolinas, acridinas, naftalenodiimidas e fenantrolinas, demonstraram ter propriedades de ligação a G4s e atividade anti-tumoral. Estas moléculas orgânicas, ao interagirem com o G4, podem afetar o crescimento tumoral de diversas formas: através da inibição da telomerase ou interferindo na função telomérica; da modulação da expressão de oncogenes pela estabilização de G4s nos seus promotores; e da regulação da biogénese de microRNAs (miRNAs) pela estabilização de G4s em precursores de microRNAs (pre-miRNAs). O cancro do pulmão (CP) é a principal causa de morte relacionada com o cancro em todo o mundo e divide-se em dois principais subtipos: o cancro do pulmão de pequenas células e o cancro do pulmão de não-pequenas células (CPNPC). Embora as opções terapêuticas convencionais, tais como a cirurgia e quimio/radioterapia, demonstrem eficácia no estadio inicial da doença, a sua eficácia é limitada no CP avançado, fase na qual a maioria dos doentes são diagnosticados. Apesar de os inibidores de controlo imunológico serem reportados na literatura como fármacos clinicamente promissores, o elevado nível de heterogeneidade molecular no CP torna o seu tratamento difícil, sendo necessário o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. A prevalência da formação de G4 em importantes regiões regulatórias do CP, incluindo proto-oncogenes (por exemplo, MYC, BCL-2, KRAS, KIT e VEGF) e regiões teloméricas, torna-os alvos terapêuticos atrativos. À semelhança do que acontece noutros tipos de cancro, também no CP a estabilização induzida por ligandos de G4 promove alterações na manutenção dos telómeros e diminui os níveis de expressão de oncogenes. A investigação atual tem evidenciado esforços contínuos de forma a utilizar ligandos para induzir a estabilização de G4 no contexto do CP, tendo diferentes classes de ligandos apresentado atividade antiproliferativa in vitro e, em alguns casos, efeitos anti-tumorais in vivo. O objetivo desta tese foi desenvolver novos ligandos de G4 derivados de 1,10-fenantrolina, capazes de ligar/estabilizar estruturas de G4 presentes em regiões regulatórias importantes no CP, atuando como agentes antitumorais. Neste trabalho, compostos heterocíclicos com núcleos derivados de fenilo, quinolina, naftaleno, acridina e fenantrolina foram avaliados relativamente ao seu efeito estabilizador de estruturas de G4 nos promotores de c-MYC, KRAS e VEGF no motivo telomérico humano e no G4 de RNA pre-MIR150. Um dos derivados de acridina avaliados foi o que apresentou a maior capacidade de estabilização nos diferentes G4s, seguindo-se de um derivado de fenantrolina. A maioria dos compostos demonstrou uma maior eficácia anti-tumoral em células de CP quando comparado com células não-malignas. Posteriormente, uma nova classe de derivados de fenantrolina foi sintetizada. O seu potencial para ligação/estabilização de sequências formadoras de G4 foi avaliado através de ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET), estudos de dicroísmo circular e de titulações de fluorescência. A atividade antitumoral in vitro destes compostos foi avaliada em linhas celulares de CP através do ensaio de MTT. Dezasseis derivados de 1,10-fenantrolina, contendo substituições nas posições 2 e 9 com cadeias laterais de amina ou amida, foram sintetizados por reações de condensação direta. Entre estes derivados, os com cadeias laterais metoxianilino e etanodiamínio demonstraram capacidade de estabilizar várias topologias de G4 derivadas de sequências teloméricas humanas, com preferência pela topologia híbrida da sequência F21T (ΔTm =7,2 – 12 °C, determinada por experiências de FRET). Os ligandos apresentaram ainda perfis citotóxicos promissores e exibiram maior eficácia em células de CP A549 comparativamente a células H1299. Além disso, foram também sintetizados dez novos derivados de 1,10-fenantrolina-2,9-bistriazóis através de reações de cicloadição azida/alcino catalisadas por cobre. Através de avaliação biofísica, foram identificados três ligandos promissores em sequências G4 de KRAS, promovendo o aumento na estabilização térmica (ΔTm =4,7 – 11,2 °C, determinada por experiências de FRET) e afinidades de ligação variando entre 10-6 e 10-9 M. A avaliação da atividade anti-tumoral revelou que o composto contendo um anel fenilo ligado à unidade de triazole exibiu um potente efeito inibitório no crescimento das células tumorais A549 e H1299 (IC50 = 14,6 e 10,9 μM, respetivamente). Os resultados experimentais demonstraram que os compostos sintetizados têm potencial para se ligar/estabilizar diferentes sequências formadoras de G4, e que podem ser úteis na otimização posterior de ligandos. Além disso, este estudo forneceu informações importantes sobre a relação estrutura-atividade para esta classe de compostos, com o objetivo de maximizar a sua atividade. Por último, e até onde sabemos, identificámos, pela primeira vez, uma região formadora de G4 dentro do precursor humano do MIR150 (pre-MIR150). O G4 formado apresentou uma topologia paralela com potencial de interagir com a nucleolina (NCL), proteína sobreexpressa na superfície celular de células cancerígenas envolvida em vários processos celulares como a tumorigénese, angiogénese e vias de sinalização. A estabilidade térmica do G4 aumentou na presença do ligando comercial de fenantrolina PhenDC3, tendo sido observada a formação de um complexo ternário G4/PhenDC3/NCL. A estrutura G4 no pré-MIR150 reconheceu células de CP positivas para a NCL que pode ser potencialmente utilizada como sonda em biópsias líquidas.
Os G-quadruplexes (G4s) são estruturas secundárias não-canónicas de ácidos nucleícos que se podem formar em regiões ricas em guanina no genoma e transcriptoma humanos. Os G4s de DNA são encontrados em regiões regulatórias importantes, como no final dos telómeros e nas regiões promotoras de vários oncogenes. Estas estruturas estão envolvidas no controlo de inúmeros processos celulares, incluindo na replicação, transcrição, estabilidade do genoma, e regulação epigenética. Por outro lado, os G4s de RNA são encontrados em regiões não codificantes estando envolvidos em processos essenciais do metabolismo do RNA, incluindo na regulação do processamento de RNA e na tradução. Devido à sua relevância biológica e características estruturais, os G4s são considerados alvos terapêuticos relevantes. A formação e estabilização de estruturas de G4, no contexto oncológico, pode ser utilizada como estratégia anti-tumoral. Várias moléculas de baixo peso molecular com elevada especificidade para G4s de DNA e RNA (ligandos de G4) foram desenvolvidas e avaliadas quanto ao seu potencial terapêutico. Ao longo dos últimos anos, inúmeros ligandos de G4 evidenciaram atividade anti-tumoral in vitro e/ou in vivo. Frequentemente, mas nem sempre, os ligandos de G4 possuem um núcleo aromático planar que permite o empilhamento π-π com o quarteto de guanina, e grupo(s) básico(s) ou carregado(s) positivamente para interação com o grupo fosfato do ácido nucleico. Diferentes compostos com estas características químicas, como quinolinas, acridinas, naftalenodiimidas e fenantrolinas, demonstraram ter propriedades de ligação a G4s e atividade anti-tumoral. Estas moléculas orgânicas, ao interagirem com o G4, podem afetar o crescimento tumoral de diversas formas: através da inibição da telomerase ou interferindo na função telomérica; da modulação da expressão de oncogenes pela estabilização de G4s nos seus promotores; e da regulação da biogénese de microRNAs (miRNAs) pela estabilização de G4s em precursores de microRNAs (pre-miRNAs). O cancro do pulmão (CP) é a principal causa de morte relacionada com o cancro em todo o mundo e divide-se em dois principais subtipos: o cancro do pulmão de pequenas células e o cancro do pulmão de não-pequenas células (CPNPC). Embora as opções terapêuticas convencionais, tais como a cirurgia e quimio/radioterapia, demonstrem eficácia no estadio inicial da doença, a sua eficácia é limitada no CP avançado, fase na qual a maioria dos doentes são diagnosticados. Apesar de os inibidores de controlo imunológico serem reportados na literatura como fármacos clinicamente promissores, o elevado nível de heterogeneidade molecular no CP torna o seu tratamento difícil, sendo necessário o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. A prevalência da formação de G4 em importantes regiões regulatórias do CP, incluindo proto-oncogenes (por exemplo, MYC, BCL-2, KRAS, KIT e VEGF) e regiões teloméricas, torna-os alvos terapêuticos atrativos. À semelhança do que acontece noutros tipos de cancro, também no CP a estabilização induzida por ligandos de G4 promove alterações na manutenção dos telómeros e diminui os níveis de expressão de oncogenes. A investigação atual tem evidenciado esforços contínuos de forma a utilizar ligandos para induzir a estabilização de G4 no contexto do CP, tendo diferentes classes de ligandos apresentado atividade antiproliferativa in vitro e, em alguns casos, efeitos anti-tumorais in vivo. O objetivo desta tese foi desenvolver novos ligandos de G4 derivados de 1,10-fenantrolina, capazes de ligar/estabilizar estruturas de G4 presentes em regiões regulatórias importantes no CP, atuando como agentes antitumorais. Neste trabalho, compostos heterocíclicos com núcleos derivados de fenilo, quinolina, naftaleno, acridina e fenantrolina foram avaliados relativamente ao seu efeito estabilizador de estruturas de G4 nos promotores de c-MYC, KRAS e VEGF no motivo telomérico humano e no G4 de RNA pre-MIR150. Um dos derivados de acridina avaliados foi o que apresentou a maior capacidade de estabilização nos diferentes G4s, seguindo-se de um derivado de fenantrolina. A maioria dos compostos demonstrou uma maior eficácia anti-tumoral em células de CP quando comparado com células não-malignas. Posteriormente, uma nova classe de derivados de fenantrolina foi sintetizada. O seu potencial para ligação/estabilização de sequências formadoras de G4 foi avaliado através de ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET), estudos de dicroísmo circular e de titulações de fluorescência. A atividade antitumoral in vitro destes compostos foi avaliada em linhas celulares de CP através do ensaio de MTT. Dezasseis derivados de 1,10-fenantrolina, contendo substituições nas posições 2 e 9 com cadeias laterais de amina ou amida, foram sintetizados por reações de condensação direta. Entre estes derivados, os com cadeias laterais metoxianilino e etanodiamínio demonstraram capacidade de estabilizar várias topologias de G4 derivadas de sequências teloméricas humanas, com preferência pela topologia híbrida da sequência F21T (ΔTm =7,2 – 12 °C, determinada por experiências de FRET). Os ligandos apresentaram ainda perfis citotóxicos promissores e exibiram maior eficácia em células de CP A549 comparativamente a células H1299. Além disso, foram também sintetizados dez novos derivados de 1,10-fenantrolina-2,9-bistriazóis através de reações de cicloadição azida/alcino catalisadas por cobre. Através de avaliação biofísica, foram identificados três ligandos promissores em sequências G4 de KRAS, promovendo o aumento na estabilização térmica (ΔTm =4,7 – 11,2 °C, determinada por experiências de FRET) e afinidades de ligação variando entre 10-6 e 10-9 M. A avaliação da atividade anti-tumoral revelou que o composto contendo um anel fenilo ligado à unidade de triazole exibiu um potente efeito inibitório no crescimento das células tumorais A549 e H1299 (IC50 = 14,6 e 10,9 μM, respetivamente). Os resultados experimentais demonstraram que os compostos sintetizados têm potencial para se ligar/estabilizar diferentes sequências formadoras de G4, e que podem ser úteis na otimização posterior de ligandos. Além disso, este estudo forneceu informações importantes sobre a relação estrutura-atividade para esta classe de compostos, com o objetivo de maximizar a sua atividade. Por último, e até onde sabemos, identificámos, pela primeira vez, uma região formadora de G4 dentro do precursor humano do MIR150 (pre-MIR150). O G4 formado apresentou uma topologia paralela com potencial de interagir com a nucleolina (NCL), proteína sobreexpressa na superfície celular de células cancerígenas envolvida em vários processos celulares como a tumorigénese, angiogénese e vias de sinalização. A estabilidade térmica do G4 aumentou na presença do ligando comercial de fenantrolina PhenDC3, tendo sido observada a formação de um complexo ternário G4/PhenDC3/NCL. A estrutura G4 no pré-MIR150 reconheceu células de CP positivas para a NCL que pode ser potencialmente utilizada como sonda em biópsias líquidas.
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