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Authors
Abstract(s)
The choroid plexus (CP), localized in the brain ventricles, forms the bloodcerebrospinal fluid barrier, which, by the presence of thigh junctions, detoxification
enzymes, and membrane transporters limit the traffic of molecules into the brain. Sex
hormones influence several CP functions, including its activity as a circadian oscillator.
This study aims to evaluate the impact of sex hormones and circadian rhythms in the
function of CPs´ membrane transporters. First, we compared the diary expression of
Abca1, Abcc1, Abcc4, Abcg4, and Oat3 transporters in the CP of male and female rats.
We observed a circadian expression of Abcc1 and Oat3 in female rats and Abcg4 in male
rats, suggesting that sex hormones influence the rhythmicity in the expression of these
transporters in CP. Next, we also compared the 24 hours transcription profile of Abca1,
Abcc1, Abcc4, Abcg4, and Oat3 in the CP of sham-operated and ovariectomized female
rats. We found that Oat3 circadian expression is dependent on ovarian hormones.
Using an in vitro model of the human blood-cerebrospinal fluid barrier, we also found
that methotrexate (MTX), a very unspecific substrate in terms of transport, is
transported in a circadian way across this barrier. Moreover, we demonstrate that
Abcc4 is also expressed in a circadian way in the human CP epithelial papilloma cells
and is partially responsible for the MTX circadian transport across the basal membrane
of choroid plexus epithelial cells.
De forma a se adaptarem às alterações diurnas, os organismos vivos desenvolveram ritmos circadianos, que correspondem a alterações com uma ritmicidade de 24 horas nas funções biológicas. Os ritmos circadianos são conduzidos por relógios moleculares que, nos mamíferos, se encontram organizados de forma hierárquica. O núcleo supraquiasmático do hipotálamo opera como oscilador central, tendo a importante função de receber a informação luminosa e sincronizar os osciladores periféricos, de acordo com a hora do dia. O plexo coroide, para além de englobar um relógio molecular modulado pelo estradiol, é responsável por formar uma barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano que, através da presença de transportadores de membrana, enzimas de destoxificação, e de junções de oclusão entre as células epiteliais limita a passagem de moléculas do sangue para o líquido cefalorraquidiano e, consequentemente, para o cérebro. Assim, o objetivo do presente trabalho é avaliar o impacto do ritmo circadiano e das hormonas sexuais em transportadores de membrana presentes no plexo coroide. Neste estudo, avaliou-se inicialmente se os transportadores de membrana Abca1, Abcc1, Abcc4, Abcg4 e Oat3 apresentam uma expressão circadiana e, por sua vez, se essa ritmicidade varia entre machos e fêmeas. Para isso, através da técnica de PCR em tempo real obteve-se o perfil diário da expressão destes transportadores no plexo coroide de ratos fêmea e macho intactos, de ratos fêmea submetidos a ovariectomia e fêmeas controlo eutanasiados a diferentes horas. Nas fêmeas intactas, observou-se uma expressão circadiana para o Abcc4 e para o Oat3, enquanto que nos machos apenas se verificou para o Abcg4. Apenas a expressão do Oat3 nas fêmeas controlo (não ovariectomizadas) apresentou ritmicidade. Para verificar se o metotrexato é transportado de forma circadiana através da barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano, foi realizado um ensaio in vitro, onde transwells cultivados com células da linha celular do plexo coroide humano (HIBCPP) foram incubados com fluoresceína-metotrexato no lado basal a diferentes horas. As concentrações de fluoresceína-metotrexato foram avaliadas nos 3 compartimentos (apical, basal e intracelular), e todos eles apresentaram ritmicidade, o que significa que o metotrexato é transportado de forma circadiana tanto através da membrana basal como da membrana apical. Sendo o metotrexato um substrato do ABCC4, fomos verificar se este estaria envolvido na ritmicidade do transporte do metotrexato através da barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano. Para isso, através de PCR em tempo real observámos que o ABCC4 é expresso de forma circadiana nas células HIBCPP. Posteriormente, o ensaio in vitro foi repetido, usando um inibidor do ABCC4, em que se verificou ritmicidade nos níveis de fluoresceína-metotrexato apenas nos compartimentos apical e intracelular. Assim, o ABCC4, que se encontra localizado na membrana basolateral das células epiteliais do plexo coroide, é responsável pela ritmicidade do transporte de metotrexato através da membrana basal. Por fim, para verificar se o ABCC4 é o único transportador responsável pela ritmicidade do transporte de metotrexato através da membrana basal, realizou-se um novo ensaio in vitro em que se inibiu o ABCG2, um transportador localizado na membrana apical. Os resultados obtidos neste ensaio foram semelhantes ao anterior, verificando-se também apenas ritmicidade nos níveis de fluoresceína-metotrexato para os compartimentos apical e intracelular, indicando que o ABCC4 não é exclusivamente responsável pela ritmicidade do transporte de metotrexato através da membrana basal. Em conclusão, demonstrámos que o Abcc4, o Abcg4, e o Oat3 apresentam uma expressão circadiana no plexo coroide, influenciada pelas hormonas sexuais. Os nossos resultados mostram também que metotrexato é transportado de forma circadiana através da barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano e que o ABCC4 está parcialmente envolvido na ritmicidade desse transporte através da membrana basal.
De forma a se adaptarem às alterações diurnas, os organismos vivos desenvolveram ritmos circadianos, que correspondem a alterações com uma ritmicidade de 24 horas nas funções biológicas. Os ritmos circadianos são conduzidos por relógios moleculares que, nos mamíferos, se encontram organizados de forma hierárquica. O núcleo supraquiasmático do hipotálamo opera como oscilador central, tendo a importante função de receber a informação luminosa e sincronizar os osciladores periféricos, de acordo com a hora do dia. O plexo coroide, para além de englobar um relógio molecular modulado pelo estradiol, é responsável por formar uma barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano que, através da presença de transportadores de membrana, enzimas de destoxificação, e de junções de oclusão entre as células epiteliais limita a passagem de moléculas do sangue para o líquido cefalorraquidiano e, consequentemente, para o cérebro. Assim, o objetivo do presente trabalho é avaliar o impacto do ritmo circadiano e das hormonas sexuais em transportadores de membrana presentes no plexo coroide. Neste estudo, avaliou-se inicialmente se os transportadores de membrana Abca1, Abcc1, Abcc4, Abcg4 e Oat3 apresentam uma expressão circadiana e, por sua vez, se essa ritmicidade varia entre machos e fêmeas. Para isso, através da técnica de PCR em tempo real obteve-se o perfil diário da expressão destes transportadores no plexo coroide de ratos fêmea e macho intactos, de ratos fêmea submetidos a ovariectomia e fêmeas controlo eutanasiados a diferentes horas. Nas fêmeas intactas, observou-se uma expressão circadiana para o Abcc4 e para o Oat3, enquanto que nos machos apenas se verificou para o Abcg4. Apenas a expressão do Oat3 nas fêmeas controlo (não ovariectomizadas) apresentou ritmicidade. Para verificar se o metotrexato é transportado de forma circadiana através da barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano, foi realizado um ensaio in vitro, onde transwells cultivados com células da linha celular do plexo coroide humano (HIBCPP) foram incubados com fluoresceína-metotrexato no lado basal a diferentes horas. As concentrações de fluoresceína-metotrexato foram avaliadas nos 3 compartimentos (apical, basal e intracelular), e todos eles apresentaram ritmicidade, o que significa que o metotrexato é transportado de forma circadiana tanto através da membrana basal como da membrana apical. Sendo o metotrexato um substrato do ABCC4, fomos verificar se este estaria envolvido na ritmicidade do transporte do metotrexato através da barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano. Para isso, através de PCR em tempo real observámos que o ABCC4 é expresso de forma circadiana nas células HIBCPP. Posteriormente, o ensaio in vitro foi repetido, usando um inibidor do ABCC4, em que se verificou ritmicidade nos níveis de fluoresceína-metotrexato apenas nos compartimentos apical e intracelular. Assim, o ABCC4, que se encontra localizado na membrana basolateral das células epiteliais do plexo coroide, é responsável pela ritmicidade do transporte de metotrexato através da membrana basal. Por fim, para verificar se o ABCC4 é o único transportador responsável pela ritmicidade do transporte de metotrexato através da membrana basal, realizou-se um novo ensaio in vitro em que se inibiu o ABCG2, um transportador localizado na membrana apical. Os resultados obtidos neste ensaio foram semelhantes ao anterior, verificando-se também apenas ritmicidade nos níveis de fluoresceína-metotrexato para os compartimentos apical e intracelular, indicando que o ABCC4 não é exclusivamente responsável pela ritmicidade do transporte de metotrexato através da membrana basal. Em conclusão, demonstrámos que o Abcc4, o Abcg4, e o Oat3 apresentam uma expressão circadiana no plexo coroide, influenciada pelas hormonas sexuais. Os nossos resultados mostram também que metotrexato é transportado de forma circadiana através da barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano e que o ABCC4 está parcialmente envolvido na ritmicidade desse transporte através da membrana basal.
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Keywords
Abcc4 Hormonas Sexuais Plexo Coroide Ritmos Circadianos Transportadores de Membrana