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- Síntese de Melatonina no Plexo CoróidePublication . Tavares, Sara Daniela Sousa; Paixão, Telma Alexandra Quintela; Santos, Cecília Reis Alves dosA melatonina é uma hormona produzida na glândula pineal que controla uma grande variedade de processos biológicos, sendo o mais importante a regulação do ciclo claro-escuro. Para além desta função a melatonina tem um importante papel como agente antioxidante, por atuar como scavenger de radicais livres e por potenciar a produção de outras enzimas antioxidantes. Na glândula pineal a sua produção apresenta oscilações circadianas, sendo libertada em elevadas concentrações durante a noite e a sua produção inibida durante o dia. Diversos estudos têm vindo a identificar outros tecidos e órgãos como produtores de melatonina, nomeadamente tecidos cerebrais como o hipocampo e cerebelo. Esta hormona é alvo de muitos outros estudos, particularmente na doença de Alzheimer, em que os seus efeitos benéficos na toxicidade induzida pelo péptido beta amilóide têm sido comprovados. Estes estudos concluíram que a melatonina é capaz de impedir a agregação do péptido em placas, proteger contra a apoptose e estimular a produção de outras enzimas antioxidantes. Como tal, este estudo teve como objetivos: confirmar a presença das enzimas envolvidas na síntese de melatonina no plexo coróide de rato; comprovar que o plexo coróide tem a capacidade de sintetizar melatonina; verificar se a sua síntese pode ser alterada por oscilações circadianas e analisar o efeito da disrupção do ritmo circadiano sob os níveis de expressão da enzima N-acetiltransferase. Foram ainda avaliados os efeitos da melatonina na expressão dos genes das proteínas scavenger do péptido beta amilóide. Observou-se que as enzimas da via de síntese de melatonina se encontram presentes no plexo coróide de rato, bem como a presença de melatonina e serotonina em meio de cultura das células epiteliais de plexo. A enzima N-acetiltransferase apresentou oscilações circadianas nos seus níveis de expressão de mRNA, no entanto a disrupção do ritmo circadiano não influenciou a sua expressão. Verificou-se também que a melatonina tem efeitos na expressão de mRNA dos genes scavenger, aumentando a sua expressão no caso da enzima de degradação da insulina, metalotioneina 2, transtirretina e gelsolina. Com a análise destes resultados, coloca-se a hipótese de que o plexo coróide pode realmente ser um tecido produtor de melatonina e que essa produção pode ser regulada pelo ritmo circadiano. Além disso, com a evidência de que a melatonina participa na regulação dos genes scavenger e como estes se encontram expressos no plexo coróide, podemos também concluir que o relógio circadiano deste tecido pode ajudar a manter o equilíbrio de produção/eliminação do péptido beta amilóide.
- Desenvolvimento de novas metodologias de purificação de DNA minicircular usando suportes monolíticosPublication . Diamantino, Tatiana Santos Roque; Sousa, Ângela Maria Almeida de; Sousa, Fani Pereira deAtualmente existem diversas patologias que não têm cura através das terapias convencionais, causando a morte a milhares de pessoas. Assim, torna-se imprescindível o desenvolvimento de terapias alternativas para a sua prevenção e tratamento. A terapia génica e as vacinas de DNA são consideradas terapêuticas promissoras no tratamento de doenças hereditárias e adquiridas. Baseiam-se na transferência de genes e requerem o uso de vetores que sejam seguros e eficientes. Os vetores virais apesar de serem mais eficientes na transferência de genes comprometem a segurança, e como tal tem havido uma crescente aposta na utilização de vetores não-virais como o DNA plasmídico (pDNA). Porém, apesar deste vetor ser mais seguro, de simples produção e de baixo custo, exibe algumas limitações associadas à presença da região de amplificação bacteriana, podendo desencadear respostas inflamatórias e imunitárias ou promover efeitos genotóxicos. Com a finalidade de ultrapassar os obstáculos inerentes ao pDNA, surgiu um novo produto biotecnológico com perspetivas terapêuticas benéficas designado por DNA minicircular (mcDNA). Esta biomolécula resulta de uma recombinação intramolecular do plasmídeo parental (PP) numa cultura bacteriana, sendo constituída exclusivamente pela unidade de transcrição eucariótica. Assim, o mcDNA é considerado um vetor mais seguro, que promove um aumento do efeito terapêutico. Contudo, por ser ainda uma abordagem recente, exige a realização de mais estudos com o objetivo de otimizar-se o processo de recombinação e desenvolver-se um método de purificação adequado, que obedeça às normas impostas pelas autoridades reguladoras, e que consequentemente permita a aplicação terapêutica deste vetor da “nova geração”. O trabalho apresentado nesta tese teve por base o objetivo de obter-se melhores rendimentos de produção de mcDNA, testando diversas percentagens de L-arabinose, e de otimizar a sua recuperação. Posteriormente, foi estudada a etapa de purificação desta biomolécula usando um suporte monolítico de troca aniónica, caracterizado por apresentar uma elevada capacidade de ligação e excelentes propriedades de transferência de massa. Os resultados revelaram que esta coluna apresenta boa resolução e seletividade para separar as impurezas da isoforma superenrolada do mcDNA. Numa primeira fase foi realizada a separação entre o DNA e o RNA, e posteriormente entre o mcDNA e o PP. Averiguou-se que o mcDNA superenrolado tem tendência a eluir primeiramente, o que poder-se-á justificar pelo seu tamanho mais reduzido, apresentando uma densidade de carga inferior. A fim de confirmar-se a pureza da amostra obtida efetuaram-se ensaios de quantificação de diversos contaminantes que revelaram a ausência de RNA e de proteínas, e que a quantidade de DNA genómico e de endotoxinas obedecia aos valores referenciados pelas agências reguladoras, como a “Food and Drug Administration” (FDA). Em suma, a utilização deste suporte monolítico pode ser uma solução promissora para a obtenção da amostra de mcDNA com a qualidade adequada para futuras aplicações terapêuticas.
- Estudo dos polimorfismos genéticos de enzimas antioxidantes nas Doenças de Alzheimer e ParkinsonPublication . Abreu, Nânci Daniela Monteiro; Granadeiro, Luiza Augusta Tereza Gil Breitenfeld; Patto, Maria da Assunção Morais e Cunha VazDoenças neurodegenerativas é um termo genérico utilizado para um espetro de condições que afetam principalmente as células neuronais. De entre as células neuronais os neurónios têm sido os mais estudados em relação a este tipo de patologia. Os neurónios são células que constituem o sistema nervoso, e são células pós-mitóticas pelo que quando são danificadas ou morrem não há hipótese de substituição (Emerit et al. 2004). As doenças neurodegenerativas são doenças incuráveis e debilitantes que resultam na progressiva degeneração e/ou morte das células nervosas. Este facto leva a que o doente apresente alterações nos movimentos (ataxia) ou que desenvolva demência (Guyton & Hall 2006). No presente trabalho as doenças neurodegenerativas abordadas são a Doença de Alzheimer e a Doença de Parkinson. Estas patologias têm em comum o facto de serem frequentemente associadas ao processo de stress oxidativo, razão pela qual é importante avaliar a capacidade de defesa antioxidante nestas patologias, como por exemplo os parâmetros genéticos das enzimas antioxidantes como a GST. Sendo assim este trabalho tem como objetivo estudar a relação dos polimorfismos GSTM1 e GSTT1 com as Doenças de Alzheimer e Parkinson. A população em estudo é constituída por 58 indivíduos de nacionalidade Portuguesa, das quais 35 foram diagnosticados com Doença de Alzheimer e 23 com Doença de Parkinson, e a população controlo é constituída por 154 pessoas. As amostras de sangue foram colhidas em papel de filtro, de onde se extraiu o DNA através do método de Chelex® 100, posteriormente se realizou a amplificação por PCR dos genes de interesse e identificou-se o genótipo através da eletroforese em gel de agarose. Os resultados mostraram que as GSTs têm influência em ambas as patologias. Na Doença de Alzheimer é de salientar que principalmente o genótipo GSTM1 “ausente” é um fator de risco para o desenvolvimento da doença. Na Doença do Parkinson os genótipos GSTM1 e GSTT1 “ausentes” parecem ser um fator de risco para os indivíduos do sexo masculino, já nos indivíduos do sexo feminino o que se verifica é a prevalência do genótipo GSTT1 “presente”.
- The role of the time-of-use electricity tariffs in the control of the rebound effect in the household energy consumptionPublication . Serras, Flávio Filipe Rodrigues; Marques, António Manuel Cardoso; Morais, PedroOne way of energy conservation and Greenhouse Gases (GHG) reduction is a more rational energy consumption. However, increased energy efficiency does not always leads to the desired outcomes regarding the reduction of consumption and consequently the reduction of GHG. The effect that makes it impossible to obtain the totality of benefits due to increasing energy efficiency is known as the rebound effect. This study aims to focus on rebound effect, controlling them by setting different prices according to the consumption period. A family production function is developed incorporating the electricity consumption, dividing them between peak and off-peak periods. The function for the direct rebound effect is calculated through the elasticity of electricity service comparing to the increased energy efficiency. The consumption variations are thus obtained in each of the periods that are associated with a particular direct rebound effect. In this perspective, a new Time-of-Use tariff (TOU) dual tariff is defined wherein the prices vary in order to cancel the full rebound effect. This way, the increased energy efficiency causes a further decrease of consumption in the critical period (peak period), promoting the smooth of the load diagram. It is proposed a partial sectioning of the dispatch priority of renewables based electricity in a special regime (SR). This procedure allows freeing resources to promote greater energy efficiency. Increased energy efficiency will be accompanied by the TOU tariff we are proposing, making these actually effective efficiency gains, since the proposed tariff ensures the control of RE.
- Effect of Antidiabetic Drugs in Human Sertoli Cells: Implications for Male FertilityPublication . Oliveira, Maria João Carvalho Meneses; Alves, Marco Aurélio Gouveia; Oliveira, Pedro Fontes; Alves, Marco Aurélio GouveiaDiabetes mellitus (DM) is a pandemic metabolic disease that affects an enormous amount of males at a very early age. It is a leading cause of morbidity and mortality, in both developed and in developing countries. Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is responsible for the vast majority of DM cases. It comprises individuals who present insulin resistance and relative insulin deficiency. Unlike type 1 diabetes mellitus (T1DM), the main triggering factor of T2DM seems to be the new lifestyle of modern societies rather than genetic factors. The process of production of viable spermatozoa is strictly regulated and dependent of several factors. Any alterations in this process may result in fertility problems in the male. The developing germ cells are dependent on the metabolic cooperation established with the Sertoli cells (SCs), being reliant on the lactate produced by these testicular somatic cells, as energy source. Of the various antidiabetics available in the market, a number of them have a direct action in the individual metabolic homeodynamics. However, its mechanisms of action are different and vary dependent on several factors (e.g. tissue or target cells). In this work, we evaluated the effect of two antidiabetic drugs, pioglitazone and metformin, in human Sertoli cell metabolism (hSCs). Our results suggest that, like metformin, pioglitazone may be a suitable antidiabetic drug for young men and those in reproductive age. These novel findings suggest a possible protective role of pioglitazone to male reproductive function.
- Autogestão na diabetes: obstáculos ao tratamento e adesãoPublication . Raulino, Verónica da Silva; Silva, Cláudia Maria Gomes Mendes daEste estudo tem como objetivo perceber de que modo os obstáculos identificados no cuidado com a diabetes influenciam a autogestão da doença em doentes com diabetes A amostra total é constituída por 107 utentes, com uma distribuição por sexo muito igualitária (51,4% do sexo feminino e 48,6% do sexo masculino), com idades entre os 16 e os 70 anos e uma média de 50,02 anos (DP=12,11). A amostra foi composta por utentes com diabetes de 11 freguesias do concelho da Praia da Vitória. Como instrumentos de pesquisa foram utilizados três questionários de autorresposta: Escala de Atividades de Autocuidado com a Diabetes (versão portuguesa de Bastos & Lopes, 2004), o Hospital Anxiety and Depression Scale (versão portuguesa de McIntyre, Pereira, Soares, Gouveia e Silva, 1999) e a Escala de Problemas no tratamento da Diabetes (versão portuguesa de J. Almeida, 2003). As caraterísticas sociodemográficas foram avaliadas através de um questionário sociodemográfico e as informações clínicas sobre a doença (e.g. tempo de duração, tratamento recomendado, níveis de glicose) foram facultadas pelo profissional de saúde. A recolha da amostra foi realizada entre os meses de Fevereiro e Abril de 2015 no Centro de Saúde da Praia da Vitória na Ilha Terceira. Nesta investigação foi possível comprovar-se que o nível de obstáculos identificados no tratamento está relacionado com a da diabetes. Salientar que no que concerne aos obstáculos identificados, os que se revelaram mais impeditivos para a autogestão foram os obstáculos relativamente à alimentação e à atividade física. No que concerne às atividades de autocuidado, também a alimentação se revelou a variável como menores índices de adesão, tal como a atividade física.
- Suscetibilidade Genética ao Cancro da TiroidePublication . Raimundo, Joana Filipa Rainho; Lemos, Manuel Carlos LoureiroO carcinoma da tiroide é o cancro endócrino mais frequente, que representa cerca de 1% de todas as neoplasias malignas e cuja incidência tem vindo a aumentar. Estes tumores têm uma etiologia multifatorial que envolve condicionantes ambientais e genéticas, bem como a interação entre elas. Os carcinomas bem diferenciados são responsáveis pela grande maioria das neoplasias malignas nesta glândula e a sua etiologia ainda não é bem conhecida. Vários genes de baixa penetrância, incluindo o FOXE1, foram relacionados com a suscetibilidade para o cancro da tiroide, mas os seus efeitos podem variar entre diferentes populações. O objetivo deste estudo caso-controlo foi determinar o efeito da variabilidade da sequência de polialaninas do gene FOXE1 sobre a suscetibilidade ao cancro da tiroide esporádico, na população portuguesa e a sua correlação com os parâmetros clínicos. A população estudada incluiu um grupo de 500 doentes caucasianos com carcinoma papilar e folicular da tiroide esporádicos (411 do sexo feminino e 89 do sexo masculino, média de idades ± desvio padrão de 46.3 ± 14.0 anos) e um grupo de 502 controlos caucasianos (372 do sexo feminino e 130 do sexo masculino, média de idades ± desvio padrão de 38.3 ± 13.4 anos) que foram genotipados por PCR e análise de fragmentos por electroforese capilar. Os resultados demonstraram que os alelos com 14 repetições de alaninas (66.3% em controlos e 57.2% em doentes) e com 16 (30.0% em controlos e 36.3% em doentes) são os mais frequentemente encontrados na população portuguesa, tal como os genótipos 14Ala/14Ala (43.2% em controlos e 33.4% em doentes) e 14Ala/16Ala (41.2% em controlos e 40.2% em doentes). Detetamos diferenças significativas nas prevalências dos genótipos e alelos entre controlos e doentes com carcinomas da tiroide (p=0.0012 e p=0.0001, respetivamente). Estas diferenças foram mais notórias na população masculina estudada (p=0.0086 e p=0.0017, respetivamente), nos doentes com carcinoma papilar (p=0.0001 e p=0.0001, respetivamente), em função do tamanho do carcinoma papilar (p=0.0296 e p=0.0218, respetivamente), e em função da idade dos indivíduos (p=0.0024 e p=0.0004, respetivamente). Podemos concluir que a variabilidade da sequência repetitiva do FOXE1, sobretudo polyA com 16 ou mais resíduos, está associada ao carcinoma papilar na população portuguesa, em particular em indivíduos do sexo masculino e em indivíduos com idade maior ou igual a 45 anos, potenciando o seu papel como biomarcador. Os resultados podem ser explicados pelo efeito da sequência repetitiva do FOXE1 com 16 ou mais resíduos de alaninas na sua função como fator de transcrição, propiciando a tumorigénese na tiroide.
- Evaluation of a-beta scavengers expression in rat choroid plexus: effects of circadian rhythm and a-beta levelsPublication . Hrynchak, Mariya; Paixão, Telma Alexandra Quintela; Santos, Cecília Reis Alves dosThe choroid plexus, a highly specialized tissue, is involved in a variety of functions such as production and secretion of the cerebrospinal fluid, synthesis and secretion of several bioactive substances and constituting the blood-cerebrospinal fluid barrier. Among others, the choroid plexus has the ability to produce molecules involved in the metabolism/clearance of amyloid ß peptide such as transthyretin, gelsolin, apolipoprotein J, metallothionein 2, angiotensin-converting enzyme and insulin-degrading enzyme. Some of these amyloid ß scavengers prevent the formation and deposition of amyloid fibrils. The circadian clock, present in all mammal tissues, is synchronized by zeitgebers (e.g., light/dark) over a period of approximately 24 h. In mammals, the brain is involved in the control and coordination of the circadian rhythm, which in turn, is generated by the suprachiasmatic nucleus. Peripheral and extra-suprachiasmatic nucleus clocks exist in other brain areas which are under the control of the suprachiasmatic nucleus. Among these, stands out the choroid plexus by expressing the core clock genes that show a rhythmic expression in both females and males. The aim of this project is to analyse whether the amyloid ß scavengers are influenced by circadian rhythmicity in both sexes in rat choroid plexus explants by Real-time PCR. Moreover, it was also investigated if the expression of these genes/proteins undergoes changes using different concentrations of amyloid ß (1 µg/ml and 3 µg/ml) in rats of different ages. Also, amyloid ß scavengers expression was evaluated at different ages. For that, Real-time PCR and Western blot techniques were used. The results herein presented indicate differential expression of amyloid ß scavengers with age, sex and amyloid ß concentration. However, more studies are needed to investigate, for instance, the circadian oscillation of these genes in vitro with different amyloid ß concentrations and in vivo in Alzheimer´s Disease patients.
- The Dynamics of the Italian electricity generation system: an empirical assessmentPublication . Afonso, Tiago Jorge Lopes; Marques, António Manuel CardosoEste trabalho analisa a forma como as fontes de geração de eletricidade interagem entre si, e destas com a atividade económica, em Itália. Este é um país que passou por um período de instabilidade económica e está muito dependente da importação de eletricidade e também de matérias-primas para a geração de eletricidade. Estes fatores tornam a análise da dinâmica de interação entre fontes em Itália particularmente relevante. Com base em dados com frequência mensal, recorre-se à abordagem ARDL. Esta abordagem permite uma análise mais alargada, aplicável a variáveis I(0) e I(1), bem como permite decompor os efeitos totais em efeitos de curto e de longo-prazo. Esta análise é complementada com a causalidade Toda-Yamamoto para analisar as relações causais. Os resultados da evidência empírica revelam coerência interna e confirmam o efeito de substituição entre fonte fóssil e hídrica. A geração a partir da fonte hídrica tem sinal positivo no curto-prazo e negativo no longo-prazo. Observou-se ainda a existência de causalidade bidirecional, no longo-prazo, entre atividade económica e fontes de geração renovável, isto é, a atividade económica incentiva a geração de renováveis, não se confirmando o reverso. Este resultado está de acordo com o facto de que a contribuição das renováveis resulta eminentemente dos objetivos traçados na União Europeia. Conclui-se ainda que a dependência de energia do exterior compromete a atividade económica em Itália. Assim, os decisores de política devem estimular a produção endógena de eletricidade. Os objetivos traçados pela União Europeia deveriam ter em conta o nível de riqueza dos países. Este trabalho contém ainda uma discussão aprofundada de políticas de energia para tornar mais flexível a acomodação das fontes geração dentro do sistema.
- Obtaining a plasmid DNA vaccine against HPVPublication . Figueiredo, Vanessa Andrade; Sousa, Ângela Maria Almeida de; Sousa, Fani Pereira deThe Human papillomavirus (HPV) infection is one of the most common sexually transmitted virus and is responsible for various human epithelial lesions, including cervical cancer. The initial step for cancer progression consists in immortalization of normal epithelial cells. The carcinogenicity of HPV16 infections is associated with E6 and E7 proteins, which deregulate the host cell cycle by inhibiting tumor suppressor protein (p53) and retinoblastoma protein (pRb), respectively. DNA vaccines induce an immune response which allows the prevention or treatment of infections by viruses, bacteria and parasites. One of the best strategies used for this purpose is the plasmid DNA (pDNA). Our research group has been studying a way to effectively develop the production and purification of sc pDNA vaccine HPV16 E6/E7 through the use of a monolith modified with arginine ligands. However, it is necessary to ensure that these proteins are unable to induce cell immortalization. Thus, the E6 and E7 protein oncogenic potential was removed by introducing point mutations, which inhibit interactions of these proteins with p53 and pRb. Afterwards, affinity chromatography was used to purify sc HPV16 E6/E7MUT pDNA, taking advantage of a purification strategy with arginine monolith, previously explored by our research group for the non-mutated plasmid. A purity degree > 99% and a recovery yield of 82% was achieved, which were comprised within the values obtained in our group. After optimization of the purification strategy, impurities such as genomic DNA (gDNA), RNA, endotoxin and proteins were quantified. A significant decrease in impurities of purified sc pDNA sample was observed when compared to initial lysate sample. Finally, in vitro transfection studies were performed to evaluate the fibroblast cell transfection efficiency and the subsequent expression of the target proteins, encoded by the genes contained in the pDNA vaccine. These results allowed us to conclude that the transfection process was successful, leading to increased E6 and E7 protein expression compared to non-transfected cells.