Departamento de Química
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Browsing Departamento de Química by Field of Science and Technology (FOS) "Domínio/Área Cientifica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química"
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- Avaliação bioguiada de extractos de Eragrostis viscosaPublication . Vieira, Liliana Isabel de Oliveira; Domingues, Fernanda da Conceição; Granadeiro, Luiza Augusta Tereza Gil Breitenfeld; Mendonça, Dina Isabel Malheiros Dinis deA Medicina Tradicional Angolana faz uso de diferentes plantas que nunca foram sujeitas a estudos de actividade biológica. Este trabalho consistiu no estudo dos extractos da planta Eragrostis viscosa. Avaliou-se a sua actividade antimicrobiana e citotóxica, seguida de um posterior fraccionamento do extracto com maior actividade biológica de modo a isolar os compostos activos da planta. Com os compostos isolados realizou-se um teste de genotoxicidade. Para determinar a actividade antimicrobiana foram realizados os ensaios de difusão em disco e microdiluição de modo a determinar a MIC e a MLC dos extractos. Para o Staphylococcus aureus e Bacillus cereus efectuaram-se ainda as curvas de morte para determinar qual o possível modo de acção desses extractos sobre essas estirpes. Realizou-se o teste do MTT, em fibroblastos humanos saudáveis, de modo a verificar se os extractos eram citotóxicos ou estimulavam a proliferação celular. Os primeiros resultados mostraram que o extracto de hexano tem a maior actividade biológica, sendo assim, o extracto foi fraccionado para seleccionar as fracções responsáveis por essa actividade. Quatro compostos foram isolados, nas fracções activas: o ácido 8,15-epoxilabdan-16-óico (5); 16-acetoxi-8,15-epoxilabdano (3); 8,15-epoxi-16-norlabdan-13-ona (4) e 8,15-epoxilabdan-16-ol (6), sendo o composto 5 o maioritário presente no extracto. Os compostos 3, 4 e 6 foram estudados quanto à sua genotoxicidade através do teste do micronúcleo com a citocinese bloqueada em células V79. Os resultados mostraram que nenhum dos compostos apresentaram genotoxicidade para células V79 com e sem activação metabólica. No que respeita aos extractos, eles não apresentaram actividade antifúngica, nem actividade antibacteriana para as bactérias gram-negativas. No entanto, demonstraram o seu potencial para inibir as bactérias gram-positivas. Além disso, as curvas de morte demonstraram que os extractos brutos de hexano e diclorometano apresentaram actividade bacteriostática para as estirpes de Staphylococcus aureus e Bacillus cereus. A citotoxicidade dos extractos brutos avaliada pelo teste MTT mostrou alguns resultados positivos na maior concentração utilizada nos ensaios, no entanto, são necessários estudos adicionais para dar mais detalhes sobre este tema. Em conclusão, os extractos estudados de Eragrotis viscosa não tem actividade antifúngica, inibem as bactérias gram-positivas e apresentam actividade bacteriostática para o Staphylococcus aureus e Bacillus cereus. No entanto, para obter conclusões mais relevantes neste trabalho, são necessários mais estudos antimicrobianos e de citotoxicidade com os compostos isolados da planta.
- Biosynthesis, solubilization and purification of human membrane bound catechol-O-methyltransferase in brevibacillus choshinensis cellsPublication . Pedro, Augusto Quaresma Henriques; Passarinha, Luís António Paulino; Baptista, Cláudio Jorge MaiaAs proteínas membranares constituem cerca de 20 a 30 % de todas as proteínas codificadas pelo genoma de vários organismos. Elevadas quantidades de proteínas num estado de elevada pureza são necessárias quer para estudos farmacológicos, quer para estudos cristalográficos, daí a imperativa necessidade de desenvolver novos sistemas para a sobre-expressão heteróloga de proteínas membranares. Especificamente, nós testámos a aplicação de Brevibacillus choshinensis para a biosíntese da isoforma membranar da catecol-Ometiltransferase humana. No que diz respeito ao processo de produção, obteve-se uma moderada a elevada expressão num meio complexo com um valor de 45 nmol/h/mg para a actividade biológica da hMBCOMT, atingida às 20 horas de cultura a 37 ºC e 250 rpm. No que diz respeito à solubilização da proteína alvo, a eficiência de reconstituição para a hMBCOMT é nula na presença de detergentes iónicos tais como o SDS. No entanto, a aplicação de baixas concentrações de detergentes não-iónicos parece ser ideal para solubilizar a fracção membranar visto que a hMBCOMT recombinante retém elevados valores para a actividade biológica. Dos detergentes testados, a digitonina a 0.5 % (m/v) parece ser o mais adequado. De facto, o método descrito nesta tese é simples e poder-se-á tornar muito útil se aplicado num diagrama global para o isolamento da MBCOMT tendo em vista a sua caracterização bioquímica ou biofísica, onde se destaca a determinação da sua estrutura por cristalografia de raios-X ou estudos de interacção da hMCOMT com inibidores.
- Desenvolvimento de um biomaterial de alumina para futura aplicação em regeneração ósseaPublication . Rodrigues, Miguel Ângelo Azenha; Correia, Ilídio Joaquim SobreiraO osso é um tecido conjuntivo muito complexo, e é um dos mais resistentes do organismo. É fundamental na capacidade de carga do esqueleto, e apresenta funções mecânicas, metabólicas, de suporte e de protecção. As lesões ósseas ocorrem devido à idade, mas também devido a traumatismos e doenças. O processo de reparação óssea é muito dinâmico e envolve uma série de fenómenos: migração, diferenciação, proliferação celular e síntese da matriz extracelular óssea. Quando um biomaterial é inserido num defeito ósseo, o organismo reconhece o biomaterial como um corpo estranho, desencadeando um conjunto de respostas que visam a reparação óssea, mas podendo também rejeitar o biomaterial e desencadear uma resposta inflamatória. Neste trabalho, um novo scaffold de alumina foi produzido, através de um processo inovador, para que futuramente possa ser usado na regeneração. O material foi caracterizado mecanicamente, através de ensaio de dureza, resistência, porosidade e absorção de água. Biologicamente, o material foi caracterizado através de ensaios in vitro com osteoblastos humanos: ensaio do brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazolio], para avaliar a citotoxicidade do mesmo, e Microscopia Electrónica de Varrimento, para observar a adesão ou não das células ao material. Foram também realizados ensaios in vivo, inserindo o material em defeitos ósseos induzidos em ratos Wistar, de modo a caracterizar o material quanto à sua biocompatibilidade e capacidade de osteointegração. Os ensaios mecânicos revelaram que o material possui uma elevada resistência mecânica, assim como uma densidade semelhante à do osso, e uma porosidade que permite os osteoblastos aderirem ao material. Os ensaios in vitro, revelaram que o material não é citotóxico e que permite a adesão celular na sua superfície. No entanto, os resultados in vivo, não confirmaram os dados obtidos in vitro, uma vez que a análise histológica revelou que o material induz inflamação a curto e a longo prazo no local de implantação. Tal resultado, permite afirmar, que este material desencadeia uma resposta inflamatória local, tendo estes resultados relevância clínica, uma vez que a alumina é muito usada no revestimento de próteses dentárias e femorais, e desse modo, este trabalho levanta algumas questões quanto à fiabilidade de se usarem dispositivos produzidos com este material, e em que o mesmo contacta directamente com os tecidos.
- Determinação de antiepilépticos em amostras de plasma humano por cromatografia líquida acoplada a um detector de fotodiodosPublication . Geraldes, Virgínia Sofia; Gallardo Alba, Maria Eugénia; Barroso, Mário Jorge DinisA taxa de incidência de epilepsia na maioria dos países desenvolvidos é, hoje em dia, de cerca de 40-70 por 100 000 indivíduos. As crises epilépticas são normalmente controladas com auxílio dos fármacos antiepilépticos, estando disponível um grande número de agentes terapêuticos. A possibilidade real de ocorrerem interacções entre estes fármacos, o advento da internet e o problema crescente da automedicação podem levar a um aumento considerável do número de intoxicações devidas a estes compostos. Deste modo, são necessários métodos analíticos rápidos e sensíveis para a quantificação fidedigna destes compostos em amostras biológicas humanas, para dar auxílio e assistência aos serviços de emergência no tratamento de indivíduos intoxicados. O objectivo deste trabalho foi então o desenvolvimento e validação de um método para a determinação quantitativa de quatro fármacos antiepilépticos (primidona, carbamazepina, fenitoína e fenobarbital) e o metabolito da carbamazepina (10,11-epoxi-carbamazepina) em plasma humano, utilizando extracção em fase sólida e cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a um detector de fotodiodos (HPLC-DAD). Utilizando um volume de amostra de apenas 0,2 mL, o método foi completamente validado de acordo com normas internacionalmente aceites para a validação de métodos bioanalíticos. Os parâmetros estudados foram selectividade, linearidade, limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ), precisão e exactidão, estabilidade em amostras processadas e em ciclos de congelação/descongelação, e eficiência de extracção. O método foi selectivo, já que não foram detectados interferentes após análise de amostras brancas de plasma de 20 origens diferentes, tendo sido obtida uma resposta linear entre 0.25 e 25 μg/mL para todos os compostos, excepto para a carbamazepina (0.1-25 μg/mL), primidona (1-25 μg/mL) e fenitoína (0,5-25 μg/mL). Os valores obtidos para a precisão e exactidão intra- e interdia estavam em conformidade com os critérios de validação mencionados, i.e., coeficientes de variação inferiores a 15% e bias dentro de um intervalo de ±15% da concentração teórica (excepto no limite inferior de quantificação, para o qual 20% foi considerado adequado). A eficiência de extracção foi superior a 90% para todos os compostos. Finalmente, o método foi aplicado a quatro casos de intoxicação, nos quais alguns destes fármacos estavam presentes. Em conclusão, o método desenvolvido provou ser útil para a determinação destes fármacos antiepilépticos em situações de intoxicação clínica ou forense.
- Determinação de marcadores de exposição ao tabaco em amostras de fluido oral de indivíduos não fumadoresPublication . Fonseca, Beatriz Marques da; Alba, Maria Eugénia Gallardo; Calheiros, José Manuel Lage CampeloA exposição à poluição tabágica ambiental constitui um sério problema de saúde pública, já que os fumadores passivos estão expostos a mais de quatro mil substâncias tóxicas, entre as quais dezenas de cancerígenos e nicotina, principal agente responsável pelo desenvolvimento da dependência ao tabaco. Este alcalóide de ocorrência natural deriva das folhas de tabaco e é rápida e extensivamente metabolizado no fígado para formar uma larga variedade de metabolitos. A exposição crónica à nicotina, a droga mais consumida em todo o planeta, é responsável pela aparição de problemas de saúde como cancro, doenças do foro respiratório e neurológico, entre outros. Como problema de saúde pública, é uma prioridade conhecer a verdadeira prevalência de indivíduos expostos a este tipo de poluição. Assim o principal objectivo do presente estudo é a determinação de nicotina e os seus principais metabolitos, cotinina e trans-3- hidroxicotinina em amostras de fluido oral por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa em tandem, de forma a avaliar a exposição de não fumadores a estas substâncias. A metodologia proposta foi validada de acordo com critérios internacionalmente aceites para a validação de métodos bioanalíticos da Food and Drug Administration (FDA). Utilizando apenas 200 μL de amostra, o método demonstrou ser linear no intervalo de concentrações de 0,5 a 1000 ng/mL, exacto e preciso. Os limites de detecção e quantificação foram de 0,5 ng/mL e a eficiência de extracção foi superior a 85% para todos os compostos de estudo. Tendo em conta os resultados obtidos, podemos afirmar que a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa em tandem é uma poderosa e indispensável ferramenta que providencia uma elevada sensibilidade para a quantificação simultânea de biomarcadores de exposição ao fumo de tabaco num volume reduzido de fluido oral.
- Development of new therapeutic strategies for siRNA deliveryPublication . Pereira, Patrícia Alexandra Nunes; Sousa, Fani Pereira de; Figueiras, Ana RitaThe importance of RNA in numerous biological processes has increased substantially over recent years. Small RNAs (sRNAs) are increasingly recognized as crucial regulatory molecules in all organisms and the specificity and potency of small RNAs suggest that they might be promising as therapeutic agents, namely in interference RNA strategies. These strategies generally rely on the use of synthetic siRNA. Although the synthesis of siRNA can be very efficient, the oligonucleotides typically present contaminants, which leads to the need for the development of new processes for the production of highly purified and clinically suitable siRNA oligonucleotides for use in therapy. Rhodovulum sulfidophilum have the ability to produce active extracellular sRNA; therefore, the potential use of this organism to obtain functional recombinant sRNA with large therapeutic applicability is eminent. However, the success of sRNA therapies depends upon the ability to selectively and efficiently deliver therapeutic sRNA to target organ with minimal toxicity. For this purpose, novel nanodevices and vehicles have been formulated with materials that possess ideal intrinsic transfection and unpacking characteristics. In order to optimize the production of Rhodovulum sulfidophilum DSM 1374 extracellular sRNAs, the influence of temperature and NaCl concentration on the specific growth rate and in extracellular sRNA production were evaluated. The experiments performed showed that the aerobic cultivation in the dark, with nutrient broth medium containing 3 % NaCl at 30 ºC, conducted to a maximum production of extracellular sRNAs yielding 197 ± 0.55 Mg/mL. For the improvement of the biological effect in RNAi-based therapies, the design and synthesis of optimal non-viral vectors for sRNA delivery, using commercial polymers, such as Polyethylenimine, Chitosan and Poly(allylamine) were performed. The results obtained showed that the structural and physicochemical properties (size, zeta potential and morphology) of the nanoparticles are strongly dependent on polycation molecular weight, charge density and structure, and also on the formulation ratio of amine to phosphate groups present in the RNA (N/P ratio) and, ultimately, alterations in these parameters influence the association efficiency and stability of sRNA. Overall, the implementation of this cutting-edge approach provides the basis for the future development of effective sRNA-based gene therapy applications.
- Efeito do 17-beta-estradiol na expressão da transtirretina e da metalotioneína 1-2 numa linha celular de plexo coroideu de ratoPublication . Costa, Marta Isabel Nunes; Gonçalves, Isabel Maria Theriaga Mendes Varanda; Santos, Cecília Reis Alves dosO envelhecimento progressivo das populações dos países ocidentais, tem vindo a agravar a incidência de patologias neurodegenerativas, nomeadamente da doença de Alzheimer (AD). Esta patologia caracteriza-se pela deposição extracelular de fibrilhas do péptido β amilóide (Aβ) no córtex cerebral, levando à degeneração das células nervosas circulantes. A transtirretina (TTR), sintetizada principalmente no fígado e plexos coroideus (CPs), parece sequestrar o Aβ, prevenindo a formação dos agregados amilóides. As metalotioneínas (MTs) são proteínas de baixo peso molecular cuja expressão parece estar alterada em cérebros com AD. O aumento da expressão de MT-1/2 e a diminuição de MT-3 em doenças neuroinflamatórias tem suscitado um interesse crescente no papel destas proteínas na patogénese da AD. O reconhecimento das funções da MT-1/2 na captação de espécies reactivas de oxigénio (ROS), na viabilidade neuronal e no controlo da concentração de iões metálicos envolvidos na agregação amilóide, tem reforçado o interesse da proteína na neurodegeneração e neuroprotecção. Contudo, dados recentes indiciam que a MT-1/2 pode comprometer a remoção de Aβ, ao interagir com a TTR. Nesta perspectiva, o esclarecimento dos mecanismos que controlam os níveis de TTR e de MT-1/2 nos CPs pode prestar um contributo valioso ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas e de diagnóstico para a AD. Com este trabalho pretendeu-se avaliar o efeito de uma hormona com conhecidos efeitos neuroprotectores, o estradiol (E2,) na expressão de TTR e de MT-1/2 nos CPs, recorrendo a uma linha celular de CP de rato (RCP). Foi ainda objectivo deste trabalho optimizar as condições de transfecção das linhas celulares RCP, com Lipofectamine 2000TM, e HEK 293, pelo método do CaCl2, com o intuito de estabelecer metodologias práticas e eficazes para futuros estudos. As culturas da linha celular RCP foram estimuladas com várias concentrações de E2 (0, 1, 10, 100 e 1000nM) durante 6, 12, 24 e 36h. Os extractos proteicos das células foram analisados por Western blot para avaliar os níveis de expressão de TTR e de MT-1/2. Nas células tratadas com E2, os níveis de expressão de TTR aumentaram às 12h de estímulo com hormona a 10 e 100nM (p< 0,05). O efeito da hormona esteróide foi máximo às 24h de estímulo com E2 a 10nM (p< 0,001), sendo os níveis de proteína aproximadamente 2 vezes mais elevados que nas células não estimuladas. Relativamente ao efeito da hormona na expressão de MT-1/2, os resultados revelaram aumentos significativos às 12h de estímulo para todas as concentrações de hormona testadas. 24h após o estímulo hormonal, a expressão de MT-1/2 permaneceu significativamente elevada, comparativamente ao controlo (0nM), sendo o efeito atenuado às 36h de estímulo. Posto isto, conclui-se que o E2 regula positivamente a expressão de TTR e MT-1/2 na linha celular RCP e este efeito pode constituir um mecanismo importante subjacente ao efeito neuroprotector da hormona. As experiências efectuadas para a optimização da transfecção em HEK 293 com CaCl2 mostraram que o pH e concentração dos tampões, a densidade celular e a concentração de plasmídeo são parâmetros críticos no processo de transfecção. Obteve-se uma eficiência de transfecção entre os 40 e os 60%, usando 5μg de plasmídeo, CaCl2 a 300mM, tampão HBS 2x pH 7,05 e uma densidade celular entre os 60-80%. No caso da transfecção na linha RCP com Lipofectamine 2000TM terão que se testar mais condições para optimizar a técnica.
- Estudo da actividade antibacteriana de diversos óleos essenciaisPublication . Rodrigues, Cleide Vanessa Ferreira; Rocha, Pedro Miguel Mendonça; Lopez Rodilla, Jesus MiguelOs conhecimentos acerca das plantas medicinais e da sua utilização têm vindo a ser acumuladas desde a antiguidade até aos nossos dias. Os óleos essenciais são misturas naturais muito complexas que podem conter cerca de 20-60 componentes em concentrações bastante diferentes e podem ser extraídos a partir das plantas aromáticas. Geralmente, os componentes principais dos óleos essenciais determinam as suas propriedades biológicas. Há algum tempo atrás, reconheceu-se que alguns óleos essenciais exibiam propriedades antimicrobianas. Actualmente, existem diversos métodos de screening para definir se o extracto de uma determinada planta possui actividade antimicrobiana. Os dois métodos mais utilizados são os de difusão em agar e de diluição em caldo. Então, o principal objectivo deste trabalho foi determinar a actividade antibacteriana dos óleos essenciais Guaiaco wood (e Bulnesol), Schinus molle, Lavandula luisieri (obtido das folhas e das flores), Mentha cervina, Lippia alba e Thymus mastichina contra Escherichia coli, Salmonella spp e Staphylococcus aureus, utilizando o método de difusão em agar com cavidades cilíndricas (poços) para a determinação dos halos de inibição, o método de macrodiluição para a determinação da concentração mínima inibitória (CMI) e da concentração mínima bactericida (CMB) e o teste em placa para a determinação do efeito de vapor. De acordo com os resultados obtidos, destacam-se as actividades antibacterianas contra Staphylococcus aureus ATCC 25922, dos óleos Schinus molle, Lavandula luisieri (folhas e flores) e Lippia alba, e contra as estirpes Gram-negativas (Escherichia coli ATCC 25923 e Salmonela spp) dos óleos Thymus mastichina e Mentha cervina.
- Estudo da actividade antibacteriana dos óleos essenciais: Schinus mollePublication . Pombo, Eunice Baltazar; Rocha, Pedro; López Rodilla, Jesus MiguelOs conhecimentos acerca das plantas medicinais e da sua utilização têm vindo a ser acumuladas desde a antiguidade até aos nossos dias. Tem havido uma necessidade crescente de encontrar novos métodos para reduzir ou eliminar patógenos de origem alimentar. Os óleos essenciais são definidos como compostos voláteis, naturais e complexos caracterizados por um odor forte, formados em plantas aromáticas como metabolitos secundários. Podem conter cerca de 20 a 60 componentes em concentrações bastante diferentes e são caracterizados por dois ou três componentes maioritários em concentrações bastante elevadas (20-70%). Normalmente, os componentes maioritários determinam as propriedades biológicas dos óleos essenciais. A Schinus molle (aroeira-falsa), da família Anacardiaceae, nativa da América do Sul possui um óleo essencial com actividade antibacteriana. Os principais componentes que foram isolados da S.molle são cetoácidos triterpenóides. Actualmente, existem diversos métodos de screening para definir se o extracto de uma determinada planta possui actividade antimicrobiana. Os dois métodos mais utilizados são os de difusão em agar e de diluição em caldo. Então, o principal objectivo deste trabalho foi determinar a actividade antibacteriana do óleo essencial Schinus molle utilizando o método de difusão em agar com cavidades cilíndricas (poços) para a determinação dos halos de inibição, o método de macrodiluição para a determinação da concentração mínima inibitória (CMI) e da concentração mínima bactericida (CMB) e o teste em placa para a determinação do efeito de vapor. As estirpes estudadas foram: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. De acordo com os resultados obtidos, o óleo essencial de Schinus molle, tem efeitos antibacterianos fortes sobre bactérias Gram-positivas e mais fracos sobre as bactérias Gram-negativas. Os componentes maioritários têm bastante influência sobre esses efeitos antibacterianos, reagindo sinergicamente entre eles e potenciando os efeitos. O que se encontra em maior quantidade é o sabineno, no entanto a maior inibição bacteriana encontrada não foi provocada apenas pelo Sabineno, mas pela interacção entre este composto e os Pinenos (α-pinene and β-pinene).
- Prevalência de autoanticorpos com valor preditivo em dadores de sangue portuguesesPublication . Geraldes, Ana Patrícia Bernardo; Tomaz, Cândida Ascensão Teixeira; Ratado, Paulo Manuel Tavares Vicente BejaExiste um conjunto de doenças que se assemelham entre si pelo facto de apresentarem danos em órgãos e tecidos que decorrem de respostas a antigénios do próprio. A essas doenças dá-se o nome de doenças auto-imunes. Estas apresentam uma prevalência e incidência distintas entre si, sendo superiores no sexo feminino e aumentando com o decorrer da idade. Existem autoanticorpos que são mais prevalentes em certas doenças auto-imunes, no entanto, nem todos podem predizer com exactidão a ocorrência de doença. Apesar disso, tem-se conhecimento que existem autoanticorpos que se encontram no soro de doentes até 10 anos antes do início do aparecimento da doença. Este estudo pretendeu avaliar a prevalência dos anticorpos anti-Saccharomyces cerevisiae, os anticorpos anti-mitocondriais, os anticorpos anti-nucleares, os anticorpos antifosfolípidos, anticorpos anti-péptidos cíclicos citrulinados, factor reumatóide, anticorpos antigliadina e anticorpos anti-transglutaminase tecidular. Para isso, foram executados métodos de análise e métodos de confirmação, tendo-se contabilizado como apresentando autoanticorpos apenas os dadores que apresentaram positividade nos métodos confirmatórios. Obteve-se uma prevalência de autoanticorpos no total da população de 12,54%,o que está dentro dos valores encontrados na bibliografia. Os resultados obtidos revelam uma maior prevalência de autoanticorpos em dadores do sexo feminino e um aumento da prevalência de autoanticorpos no decorrer da idade. Para a totalidade dos dadores os autoanticorpos mais prevalentes foram os anticorpos anti-Saccharomyces cerevisiae (IgA e IgG) seguidos do factor reumatóide, tendo-se obtido os mesmos resultados quando se analisam apenas os dadores masculinos. A prevalência nos dadores femininos foi distinta, apresentando como autoanticorpos mais prevalentes os anticorpos anti-Saccharomyces cerevisiae (IgA e IgG), seguindo-se os anticorpos anti-fosfolípidos. Verifica-se a necessidade de se fazerem estudos e exames complementares de modo a confirmar os resultados obtidos neste trabalho.