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- Clinical isolates of Acinetobacter baumannii from a Portuguese hospital: PFGE characterization, antibiotic susceptibility and biofilm-forming abilityPublication . Duarte, Andreia; Ferreira, Susana; Almeida, Sofia; Domingues, F.C.Acinetobacter baumannii is an emerging pathogen associated with nosocomial infections that in addition has shown an increasing resistance to antibiotics. In this work the genetic diversity of A. baumannii isolates from a Portuguese hospital, their antibiotic resistance profiles and ability to form biofilms was studied. Seventy-nine clinical A. baumannii isolates were characterized by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) with 9 different PFGE profiles being obtained. Concerning the antimicrobial susceptibility, all A. baumannii isolates were resistant to 12 of the 17 tested antibiotics and classified as multidrug-resistant (MDR). In addition, 74.7% of the isolates showed biofilm formation ability, however no statistical significance with antibiotic resistance was observed. In contrast, urine samples isolates were more likely to form biofilms than strains isolated from other sources. Our findings highlight the high number of MDR A. baumannii isolates and the importance of the formation of biofilms as a potential virulence factor.
- Effect of Coriander Oil (Coriandrum sativum) on Planktonic and Biofilm Cells of Acinetobacter baumanniiPublication . Duarte, Andreia; Ferreira, Susana; Oliveira, Rosário; Domingues, F.C.The increasing incidence of hospital-acquired infections caused by multi-drug resistant pathogens, such as Acinetobacter baumannii, coupled with the low efficacy of drugs and rising treatment costs has created interest in the potential antimicrobial properties of natural products. The main objective of this work was to determine the effect of coriander essential oil on Acinetobacter baumannii in different growth phases, as well as its ability to inhibit the formation or eradication of biofilms. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of coriander oil using a microdilution broth susceptibility assay was determined. The effects of different concentrations of coriander oil (ranging from 0.125 to 4×MIC) on biofilm formation and on established biofilm were tested using 96-well microtiter plates. Crystal violet assay was used as indicator of total biofilm biomass and the biofilm viability was assessed with a XTT staining method. It was found that coriander oil presented significant antibacterial activity against all tested strains of A. baumannii, with MIC values between 1 and 4 μL/mL. The MBC values were the same as the MIC, being an indicator of the bactericidal activity of this essential oil. In what concerns the effect of this essential oil on biofilm formation inhibition was observed of at least 85% of biomass formation by all A. baumannii strains using 2×MIC of coriander oil, in addition to a decrease in the metabolic activity of the cells. After exposure to coriander oil, a decrease in 24 h and 48 h-old biofilm biomass and metabolism was seen for all tested concentrations, even with sub-inhibitory concentrations. Coriander essential oil proved to have a significant antibacterial and anti-biofilm activity and should be considered in the development of future disinfectants to control A. baumannii dissemination.
- Estudos de susceptibilidade e formação de biofilmes de várias estirpes de Acinetobacter BaumanniiPublication . Duarte, Andreia Filipa Silvestre; Domingues, Fernanda da Conceição; Ferreira, SusanaO aumento da severidade das patologias tem levado ao uso excessivo e por vezes inadequado de antibióticos. Esta situação tem contribuído para o aparecimento de estirpes bacterianas multirresistentes que são motivo de preocupação a nível hospitalar. O Acinetobacter baumannii é um microrganismo associado a infecções nosocomiais e responsável por uma grande percentagem de infecções adquiridas nas unidades de cuidados intensivos em todo o mundo. Esta bactéria é ubiquitária e frequentemente saprófita, tendo a capacidade de sobreviver por períodos muito longos em ambientes hospitalares, devido à capacidade de aderir a superfícies e formar biofilmes. O crescente aumento de estirpes de A. baumannii resistentes a antibióticos e a sua elevada capacidade de formação de biofilmes torna urgente a modificação dos actuais métodos de tratamento e a investigação de alternativas terapêuticas. Os agentes naturais, nomeadamente os óleos essenciais, podem ser uma alternativa promissora, relativamente aos antibióticos convencionais, uma vez que há vários relatos das suas propriedades antimicrobianas. O óleo essencial de sementes de Coriandrum sativum, para além da sua frequente utilização na indústria alimentar, também é conhecido como um potente agente antibacteriano. Neste trabalho avaliou-se o potencial antimicrobiano do óleo essencial de sementes de Coriandrum sativum sobre A. baumannii quer em células planctónicas quer em biofilmes, assim como o eventual efeito sinergético entre antibióticos e o óleo essencial e o seu efeito em eritrócitos humanos. Foi ainda estudada a motilidade e capacidade de formação de biofilmes de isolados clínicos de A. baumannii com resistência a múltiplos antibióticos convencionais. Os resultados sugerem que o óleo essencial de sementes de coentros tem um rápido efeito bactericida em A. baumannii, tanto em células em fase exponencial como em fase estacionária de crescimento, e que este óleo em combinação com cloranfenicol, ciprofloxacina, gentamicina ou tetraciclina tem um efeito sinergético. Também foi evidenciado que este óleo inibe a formação de biofilmes e promove a dispersão de biofilmes previamente formados. Por fim, ainda se observou que todas as estirpes clínicas apresentaram capacidade de formar biofilmes, não se verificando relação entre a capacidade de formação de biofilme e a amostra onde foi isolada a estirpe, o sexo do paciente, a resistência a antibióticos ou a motilidade. Assim, o óleo essencial de sementes de coentros mostrou grandes potencialidades no controlo de infecções e na dispersão de biofilmes formados por A. baumannii, mostrando ser um potencial agente terapêutico contra infecções por este microrganismo, com a particularidade de não apresentar citotoxicidade em eritrócitos humanos.
- Resveratrol inclusion complexes: Antibacterial and anti-biofilm activity against Campylobacter spp. and Arcobacter butzleriPublication . Duarte, Andreia; Alves, Ana C.; Ferreira, Susana; Silva, Filomena; Domingues, F.C.Worldwide, the consumption or handling of contaminated food has been described as one of the major causes of foodborne illness with campylobacteriosis being the most commonly reported zoonosis. Campylobacter jejuni and Campylobacter coli are considered the major cause of bacterial gastroenteritis, while Arcobacter spp. are also known to be human and animal pathogens. Furthermore, these bacteria are able to form biofilms which have become a relevant issue in a wide range of food industries since they are more resistant to disinfectants and so, more difficult to eliminate. This question gives rise to the research on the use of alternative substances that can effectively prevent biofilm formation or eradicate the biofilm already formed. Given this, the aim of this study was to evaluate the antimicrobial and anti-biofilm activity of resveratrol-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin inclusion complexes (IC) against C. jejuni, C. coli and A. butzleri as well as their quorum sensing (QS) inhibition activity. Besides improving resveratrol solubility, the ICs showed anti-Campylobacter and anti-Arcobacter activity, inhibited biofilm formation and promoted the biofilm dispersion even at sub-MIC concentrations for both genera. It was also demonstrated the anti-QS activity of the ICs through the inhibition of violacein production by Chromobacterium violaceum. In conclusion, since the use of natural compounds can improve the safety and security of foods, our results showed that this IC could be developed as a new anti-biofilm agent and QS inhibitor to enhance the shelf-life and safety of foods.
- Natural compounds as new antibacterials to control Campylobacter sppPublication . Duarte, Andreia Filipa Silvestre; Domingues, Fernanda da Conceição; Oleastro, Mónica Alexandra de SousaAs doenças de origem alimentar continuam a ser um problema comum em todo o mundo. Ainda que possam ser provocadas por diversos agentes, são as bactérias, os vírus ou os parasitas a principal causa das infeções alimentares. O consumo ou processamento de alimentos contaminados têm sido descritos como as principais vias de transmissão para os humanos. Campylobacter jejuni e Campylobacter coli têm sido descritos como a principal causa de gastroenterite bacteriana em seres humanos em todo o mundo e em 2013, na União Europeia, a campilobacteriose, infeção causada por Campylobacter, foi a zoonose mais relatada. Nos seres humanos, as espécies de Campylobacter têm sido associadas a uma variedade de condições gastrointestinais, tais como gastroenterite, doenças inflamatórias do intestino, cancro colon-rectal, síndrome do intestino irritável, entre outras e também podem provocar manifestações extra-gastrointestinais, como bacteremia, infeções pulmonares e abcessos. As complicações pós-infeção por este microrganismo incluem a artrite reativa e podem conduzir a doenças auto-imunes, tais como a síndrome de Guillain-Barré. A maioria das infeções por Campylobacter não necessita de intervenção terapêutica sendo apenas necessária reidratação. No entanto, em pacientes imunodeprimidos, pacientes cujos sintomas são severos ou persistentes e aqueles com infeções extra-intestinais é utilizado tratamento antimicrobiano, sendo os antibióticos mais utilizados a eritromicina e a ciprofloxacina. No entanto, em todo o Mundo tem-se verificado que as estirpes de Campylobacter são cada vez mais resistentes a antibióticos, incluindo os usados em humanos. Para além disso também têm sido descritas estirpes de Campylobacter resistentes a desinfetantes, o que se deve, principalmente, à sua capacidade de formar biofilmes. Estes biofilmes são um problema emergente na indústria alimentar, aumentando a possibilidade de contaminações ao longo da cadeia alimentar. Assim, e como os estudos relativos a Campylobacter são escassos, é da maior relevância estudar a epidemiologia de espécies de Campylobacter isoladas em Portugal, a sua resistência a antibióticos e procurar alternativas, aos antimicrobianos convencionais, para o seu controlo. Devido à escassez de estudos relativos à epidemiologia de Campylobacter em Portugal procedeu-se neste trabalho ao estudo da distribuição epidemiológica de isolados de Campylobacter de seres humanos, entre 2009 e 2012, em Portugal. Para isso, foram analisadas 837 estirpes obtidas através do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. Destas 837 estirpes, 84,5% foram identificados como C. jejuni, 14,8% como C. coli, 0,2% como C. upsaliensis, 0,1% como C. concisus e 0,2% das amostras foram identificadas como Arcobacter butzleri. Em relação à sua distribuição por faixas etárias, observou-se que 61,5% das estirpes pertenciam ao grupo com idades entre 1 e 15 anos. Após este estudo preliminar, a partir deste grupo de isolados humanos, escolheram-se aleatoriamente 125 estirpes de Campylobacter (C. jejuni e C. coli) isoladas de seres humanos. A este grupo de estirpes, adicionaram-se 39 isolados de retalho alimentar e 32 de animais. As 196 amostras foram então caracterizadas através da tipagem por sequenciamento multilocus e da tipagem do gene flaA. Através destes métodos de tipagem, observou-se que as estirpes de C. coli eram geneticamente mais conservadas do que C. jejuni e que dentro de cada espécie, existiam isolados geneticamente relacionados provenientes de fontes diferentes. Em seguida, o fenótipo de resistência ao ácido nalidíxico, amoxicilina, ciprofloxacina, eritromicina, gentamicina e tetraciclina foi avaliado pelo método de diluição em agar. Observaram-se elevadas taxas de resistência para todos os antibióticos com exceção à gentamicina, incluindo para os antibióticos utilizados no tratamento de campilobacteriose grave em humanos. Além disso, observou-se um fenótipo de resistência a múltiplos antibióticos (resistência a 3 ou mais classes de antibióticos) em 86% dos isolados. Perante os elevados níveis de resistência observados, estudaram-se os mecanismos moleculares subjacentes a essas resistências. Verificou-se que todos os isolados resistentes à ciprofloxacina possuíam a mutação Thr-Ile-86 na região que determina resistências às quinolonas no gene gyrA. Para a resistência à eritromicina apenas foi detetada a mutação A2075G no gene 23S rRNA. Em relação à resistência à gentamicina, observou-se que as três estirpes resistentes à gentamicina possuíam o marcador de resistência aos aminoglicosídeos aphA-3, sendo que uma das estirpes tinha uma mutação neste marcador. Foi ainda evidenciado neste estudo, que as bombas de efluxo cmeABC também podem desempenhar um papel na resistência a múltiplas drogas e no fenótipo da resistência a gentamicina. Assim, neste estudo foi possível obter uma visão geral da epidemiologia de Campylobacter em Portugal e descrever pela primeira vez a elevada taxa de multirresistência a antibióticos, assim como realçar o surgimento de estirpes de Campylobacter resistentes aos antibióticos de uso humano. Com base nos resultados deste estudo foram selecionadas estirpes com diferentes perfis genéticos e de resistência a antibióticos para serem utilizadas no decurso deste trabalho. Como o género Campylobacter é a principal causa de gastroenterite bacteriana e a via alimentar é a principal via de contaminação, a elevada percentagem de estirpes resistentes a antibióticos aumenta o potencial zoonótico da infeção com estirpes multirresistentes. Logo, torna-se necessário controlar o crescimento de Campylobacter nas vias mais comuns de contaminação, que são os alimentos. Assim, o objetivo seguinte deste trabalho foi avaliar o potencial do resveratrol para controlar as estirpes de Campylobacter previamente caracterizadas. Apesar do resveratrol possuir várias propriedades biológicas, incluindo antimicrobianas, a sua baixa solubilidade em água e alta instabilidade comprometem a sua aplicação. Assim, para ultrapassar estes problemas, estudou-se o encapsulamento do resveratrol com metil-β-ciclodextrina. Verificou-se que a complexação do resveratrol com esta ciclodextrina provocou um aumento de 400 vezes na sua solubilidade. Em seguida o complexo de inclusão foi caracterizado através de Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), Difração de Raios-X (XRD) e Microscopia Eletrónica de Varrimentos (SEM), confirmando-se efetivamente a sua formação. Seguidamente foram avaliadas algumas propriedades biológicas do resveratrol e do seu complexo de inclusão com metil-β-ciclodextrina, tendo-se verificado que ambos os compostos tinham atividade antioxidante muito forte, baixa toxicidade e ainda capacidade de reduzir a viabilidade das células Caco-2 (linha celular constituída por células epiteliais de adenocarcinoma colorectal heterogéneo). Além disso, também foi demonstrada a sua atividade antibacteriana contra estirpes de Campylobacter previamente selecionadas: duas estirpes de referência (C. jejuni ATCC 33560 e C. coli ATCC 33559), duas estirpes isoladas de fezes de pacientes com gastroenterite aguda (C. coli 53 e C. coli 873) e duas estirpes isoladas de carne de aves fresca (C. jejuni 225421 e C. coli 219872). Estes resultados sugerem que o resveratrol e o seu complexo de inclusão podem ser usados para controlar Campylobacter e que o resveratrol encapsulado em metil-β-ciclodextrina mantem as suas propriedades antioxidantes e antibacterianas. Uma vez que os resultados com o resveratrol e o complexo de inclusão foram bastante promissores, estudou-se ainda outro complexo de inclusão (resveratrol-hidroxipropil-γ-ciclodextrina), previamente formado e caraterizado pelo grupo de investigação, que revelou ainda ter um potencial antimicrobiano mais elevado contra Campylobacter e A. butzleri, um patogéneo de origem alimentar relacionado a Campylobacter. Dado isto, inicialmente avaliou-se a atividade antibacteriana em células planctónicas e mostrou-se que tanto o resveratrol como o complexo de inclusão têm um efeito bactericida contra as estirpes multirresistentes C. coli 873 e C. jejuni 225421. Com o objetivo de esclarecer o potencial mecanismo de ação do complexo de inclusão do resveratrol em hidroxipropil-γ-ciclodextrina sobre as estirpes de Campylobacter, começou por se avaliar a despolarização das membranas celulares e a atividade metabólica por citometria de fluxo. Através desta técnica, observou-se que complexo de inclusão pode atuar induzindo a despolarização da membrana e afetando a atividade metabólica das células. Dado que os biofilmes bacterianos são um problema emergente na indústria alimentar, também foi avaliado o potencial destes dois compostos para inibir a formação de biofilmes e eliminar biofilmes estabelecidos. Tanto o resveratrol como o complexo de inclusão foram capazes de inibir a formação de biofilmes e diminuir biofilmes previamente estabelecidos, mesmo em concentrações sub-inibitórias. O sistema quorum sensing (QS) tem sido associado à resistência antimicrobiana e formação de biofilmes, portanto, o potencial anti-QS destes dois compostos também foi estudado através da utilização de uma estirpe biossensor (Chromobacterium violaceum ATCC 12472). Verificou-se que ambos, o resveratrol e o complexo de inclusão, foram capazes de inibir o sistema QS, o que pode explicar o efeito anti-biofilme destes compostos. Assim, nestes estudos foram demonstradas as propriedades antimicrobianas e anti-biofilme do resveratrol e complexo de inclusão em estirpes de Campylobacter. Este aspeto associado ao facto de o resveratrol ser um composto de origem natural, e de também apresentar forte atividade antioxidante, encorajam futuros estudos com vista à sua aplicação como potencial conservante alimentar. Finalmente, uma vez que tem havido um interesse crescente na utilização de compostos naturais para aplicação em produtos alimentares, também foi avaliado o potencial do óleo essencial de coentros (Coriandrum sativum L.) e do seu principal composto, o linalool, para controlar Campylobacter. Ambos os compostos exibiram um efeito bactericida contra as quatro estirpes testadas (C. jejuni ATCC 33560, C. coli ATCC 33559, C. jejuni 225421 e C. coli 873) com valores de concentração mínima inibitória entre 0,5 e 1 μL/mL e observou-se que os compostos voláteis do óleo essencial de coentros também inibiram o crescimento de Campylobacter. Observou-se ainda que ambos os compostos inibiram a formação de biofilmes e promoveram a dispersão de biofilmes de Campylobacter. Como descrito anteriormente, também foi estudado o efeito destes compostos sobre o sistema QS. Foi demonstrada a atividade anti-QS do óleo essencial de coentros e do linalool através da inibição da produção de violaceína pela estirpe biossensor C. violaceum. Assim, mais uma vez, esta atividade anti-QS pode estar associada com a atividade anti-biofilme dos compostos, uma vez que o QS tem um papel importante na regulação da formação e desenvolvimento de biofilmes. Para além do potencial anti-bacteriano e anti-biofilme do óleo essencial e do linalool, também se avaliou a sua atividade antioxidante, uma vez que o processo de oxidação está relacionado com a perda da qualidade dos alimentos. Assim, observou-se que ambos os compostos têm uma elevada capacidade para inibir a peroxidação de lípidos. Em suma, os resultados demonstraram que estes compostos naturais podem ser utilizado para controlar Campylobacter e também como agentes antioxidantes para melhorar a qualidade dos alimentos. Em conclusão, neste trabalho, foram apresentados, dados recentes referentes à epidemiologia de Campylobacter em Portugal, bem como a sua diversidade genética e respetivos perfis de resistência a antibióticos. Diante disto, são necessários novos agentes antimicrobianos para controlar este patogéneo emergente de origem alimentar. Neste trabalho mostrou-se que o resveratrol e o óleo essencial de coentros, ambos compostos naturais, têm a capacidade de reduzir células planctónicas e biofilmes de Campylobacter, possuindo também várias atividades biológicas, incluindo propriedades antioxidantes. Este trabalho permitiu alargar o conhecimento sobre a epidemiologia e taxas resistência de estirpes de Campylobacter isoladas em Portugal e desenvolver novas estratégias de controlo deste microrganismo baseadas na utilização de compostos de origem natural.