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Physical and Chemical Parameters Screening for Co-Crystallization of rS -COMT-entacapone
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia::Biotecnologia | por |
| dc.contributor.advisor | Castro, Filipa Juliana Fernandes | |
| dc.contributor.advisor | Passarinha, Luís António Paulino | |
| dc.contributor.author | Fernandes, Pedro Daniel de Jesus Conde | |
| dc.date.accessioned | 2023-11-09T15:15:27Z | |
| dc.date.available | 2025-01-31T01:30:22Z | |
| dc.date.issued | 2023-03-14 | |
| dc.date.submitted | 2023-01-31 | |
| dc.description.abstract | Catechol-O-methyltransferase (COMT, EC 2.2.1.6) is the enzyme responsible for the Omethylation of substrates such as catecholamines and estrogens with a typically catechollic structure. Commonly, COMT can be stabilized through specific molecules capable of increasing its thermodynamic stability, thus preventing its denaturation and loss of activity. After ensuring optimal conditions for protein activity, stability, and purity, carrying out structural studies is the next step. In these studies, crystallization tests are carried out with the aim of forming a crystal, in which the protein molecules are organized in a regular and orderly manner, to obtain information about their three-dimensional structure. In this work, we evaluated the effect of the interaction of ionic liquids on the enzymatic activity of SCOMT and investigated the crystallization conditions of purified SCOMT fractions. Firstly, we studied the influence of two ionic liquids, choline dihydrogen phosphate ([Ch][DHP]) and 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([C4mim]Cl), on the SCOMT lysate for 12 hours by applying a storage temperature of 4 ºC or -80 ºC and whether the ionic liquids would increase the stability of the protein, evaluating its specific activity. A greater potential stabilizing effect was obtained using [C4mim]Cl at 4 °C, with an activity recovery of about 350% over 12 hours. Then, crystallization tests of purified SCOMT fractions were carried out, using the vapor diffusion (Hanging Drop) and counter diffusion methods, where several factors were evaluated, namely, temperature (4 ºC and 20 ºC), concentration and composition of the precipitating agent solution (HEPES, pH=7.5, methyl-2,4-pentanediol and Caps, pH 10.5, Li2SO4, NaH2PO4/ K2HPO4) and the influence of S-adenosyl-L-methionine (SAM) and 3.5 -dinitrocatechol (DNC), a cofactor and a COMT inhibitor, respectively. By evaluating the various factors, we were able to conclude that better results were obtained at a temperature of 20 ºC, which corresponds to a precipitating agent solution composed of Caps, pH 10.5, Li2SO4, NaH2PO4/K2HPO4 and that the steam diffusion technique showed more promising results. In addition, a high concentration of precipitates was observed throughout the tests, mostly DNC and, in the minority, salts present in the solution of the precipitating agent. In a last step, the results obtained were classified, namely, distinguishing protein crystals from salt crystals, but due to their small size, X-ray identification was not possible. Thus, as an alternative, tests such as the absorption of dyes (Timol Blue and Coomassie Blue) were carried out and the Crush Test. These tests showed inconclusive results, since, due to the small size of the crystals, it was not possible to identify their nature with certainty. | eng |
| dc.description.abstract | A catecol-O-metiltransferase (COMT, EC 2.2.1.6) é a enzima responsável pela O-metilação de substratos como as catecolaminas e os estrogénios com estrutura tipicamente catecólica. Considerando as suas funções fisiológicas e a existência de polimorfismos intrínsecos, vários estudos associam a COMT com a patogénese de inúmeras desordens neurológicas, especialmente com a Doença de Parkinson (DP) e também com doenças cardiovasculares e neoplasias hormônio-dependentes, como o cancro de mama. Devido à importância que a COMT tem no metabolismo humano, a enzima tornou-se nas últimas décadas num relevante alvo terapêutico. Desta forma, a proteína foi estudada e foi descoberto que um único gene codifica duas isoformas da proteína, uma forma solúvel (SCOMT) e uma forma ligada à membrana (MBCOMT). Especificamente, a SCOMT participa na inativação e desintoxicação de moléculas catecólicas biologicamente ativas ou tóxicas e os seus metabolitos hidroxilados, como 2-hidroxiestradiol, 2-hidroxiestrona, 4-hidroxiestradiol e 4-hidroxiestrona. O desenvolvimento de estratégias para a obtenção de rendimentos elevados de frações contendo a enzima biologicamente ativa, estável e pura permanece um objetivo essencial, aplicando-se a um nível de proteínas terapêuticas ou à realização de estudos estruturais. Uma vez que a COMT perde rapidamente a sua atividade biológica durante o processo de recuperação e armazenamento, é considerada uma enzima altamente instável e termolábil. Tipicamente, a COMT pode ser estabilizada através de moléculas específicas capazes de aumentar a sua estabilidade termodinâmica evitando assim a sua desnaturação e perda de atividade. Deste modo, as soluções estabilizadoras que foram empregues incluíram compostos que são agentes redutores como a cisteína, que geralmente, desempenha um papel na formação de ligações dissulfeto intramoleculares e intermoleculares, açúcares que protegem as proteínas da desnaturação in vivo e também foram descritos como promotores do folding e refolding de proteínas e ainda o glicerol que tem sido aplicado para termoestabilização de enzimas. Nos últimos anos, os líquidos iónicos (ILs) demonstraram uma capacidade única de preservar a estabilidade e a conformação de proteínas e prevenir a sua agregação, devido às diversas combinações de iões que lhes conferem diferentes propriedades físico-químicas. Depois de garantir as condições ótimas de atividade, estabilidade e pureza da proteína, a realização de estudos estruturais é o próximo passo. Nestes estudos são realizados ensaios de cristalização com o objetivo de formar um cristal, em que as moléculas de proteínas estão organizadas de forma regular e ordenada, para obter informação sobre a sua estrutura tridimensional. Neste trabalho, avaliámos o efeito da interação dos líquidos iónicos na atividade enzimática da SCOMT e investigámos as condições de cristalização de frações purificadas da mesma. Primeiramente, estudámos a influência de dois líquidos iônicos, di-hidrogenofosfato de colina ([Ch][DHP]) e o cloreto de 1-butil-3-metilimidazólio ([C4mim]Cl), no lisado de SCOMT por 12 horas aplicando uma temperatura de armazenamento de 4 ºC ou -80 ºC e se os líquidos iónicos aumentariam a estabilidade da proteína, avaliando-se a sua atividade específica. Um maior efeito estabilizador potencial foi obtido usando [C4mim]Cl (10 mM) a 4 ºC, com uma recuperação de atividade de cerca 350% durante 12 horas. Em seguida, foram realizados testes de cristalização de frações purificadas de SCOMT, usando os métodos de difusão de vapor (Hanging Drop) e contra difusão, onde foram avaliados vários fatores, nomeadamente, a temperatura (4 ºC e 20 ºC), a concentração e composição da solução do agente precipitante (HEPES, pH=7.5, metil-2,4-pentanediol e Caps, pH 10.5, Li2SO4, NaH2PO4/ K2HPO4) e a influência de S-adenosil-L-metionina (SAM) e 3,5- dinitrocatechol (DNC), um cofator e um inibidor da COMT, respetivamente. Ao avaliar os vários fatores, conseguimos concluir que se obtiveram melhores resultados a uma temperatura de 20 ºC, que corresponde a uma solução de agente precipitante composta por Caps, pH 10.5, Li2SO4, NaH2PO4/ K2HPO4 e que, a técnica de difusão a vapor mostrou resultados mais promissores. Além disso, foi observado ao longo dos ensaios uma elevada concentração de precipitados, na sua maioria DNC e, na minoria, sais presentes na solução do agente precipitante. Num último passo foram classificados os resultados obtidos, nomeadamente, distinguir os cristais de proteína dos cristais de sal, mas devido ao seu tamanho reduzido, a identificação por raio-X não foi possível, uma vez que os cristais precisam de ter uma dimensão de 0.1 mm de acordo com as caraterísticas do equipamento que tínhamos em disposição no Instituto de Investigação e Inovação em Saúde do Porto (i3S) . Deste modo, como alternativa, foram realizados testes como a absorção de corantes (Azul de Timol e Azul de Coomassie), que permite colorir apenas os cristais de proteína, e o Crush Test, que permite diferenciar os cristais de sal dos cristais de proteína de acordo com a facilidade que um cristal de proteína se desintegra ao aplicar uma força. Estes testes demonstraram resultados inconclusivos, uma vez que, devido à reduzida dimensão dos cristais, não foi possível identificar com certeza a natureza deles. | por |
| dc.identifier.tid | 203381890 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/13623 | |
| dc.language.iso | eng | por |
| dc.subject | Cristalização | por |
| dc.subject | Estabilidade | por |
| dc.subject | Inibidores | por |
| dc.subject | Líquidos Iónicos | por |
| dc.subject | Scomt | por |
| dc.title | Physical and Chemical Parameters Screening for Co-Crystallization of rS -COMT-entacapone | por |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.embargofct | contem dados temporariamente confidenciais | por |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | por |
| thesis.degree.name | 2º Ciclo em Biotecnologia | por |
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