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- Fatores de risco genético para adenomas hipofisários: Uma análise nacional, multicêntrica, genética e clínicaPublication . Gaspar, Leonor Isabel Mesquita ; Lemos, Manuel Carlos Loureiro de; Gonçalves, Catarina Inês Nunes PiresOs adenomas hipofisários representam, aproximadamente, 10-15% do total dos tumores intracranianos. A prevalência destes tumores foi estimada em 1:1000 na população geral, sendo mais frequentemente diagnosticados entre os 40-60 anos de idade. Estes tumores são monoclonais, tipicamente benignos e de crescimento lento, no entanto podem estar associados a um aumento da morbilidade e mortalidade através da sobreprodução hormonal e dos efeitos de massa resultantes da compressão das estruturas adjacentes ao tumor. Os tumores hipofisários mais frequentes são os prolactinomas, seguido pelos adenomas hipofisários não funcionantes. Os mecanismos subjacentes à tumorigénese hipofisária não são ainda totalmente conhecidos, pelo que uma melhor compreensão desta questão ajudará a gerir a doença. O aumento do risco associado a mutações em genes como o AIP, MEN1, CDKN1B e PRKAR1A, fornece evidências de uma predisposição genética para adenomas hipofisários familiares. A grande maioria dos adenomas hipofisários (cerca de 95%) ocorre num contexto esporádico e na ausência de predisposição genética conhecida. No entanto, três polimorfismos (rs2359536, rs10763170 e rs17083838) foram significativamente associados a adenomas hipofisários esporádicos na população Chinesa Han. O objetivo geral desta tese foi realizar um estudo de âmbito multicêntrico nacional, acerca dos fatores de risco genético para o desenvolvimento de adenomas hipofisários familiares e esporádicos, de forma a ampliar o conhecimento sobre a tumorigénese hipofisária. Numa primeira fase desta tese, foi construída uma base de dados com todas as variantes germinativas identificadas no gene AIP publicadas em casos esporádicos e familiares de adenomas hipofisários, até à data, a nível mundial. Nesta revisão, foram identificadas e avaliadas, ao nível da sua patogenicidade, um total de 158 mutações germinativas entre 562 doentes com adenomas hipofisários esporádicos ou familiares. Estas variantes estavam localizadas em toda a região codificadora e nas regiões de splicing do gene AIP. A patogenicidade de todas as variantes germinativas publicadas foi categorizada de acordo com os critérios da American College of Medical Genetic and Genomics (ACMG), utilizando todos os dados disponíveis. Do número total de doentes, 35,4% apresentavam variantes patogénicas e 24,0% apresentavam variantes provavelmente patogénicas. Na segunda fase desta tese foi determinada a frequência de mutações germinativas do gene AIP em doentes portugueses com macroadenomas hipofisários esporádicos de início precoce. Para isso, foi sequenciado o gene AIP em 218 doentes com macroadenomas hipofisários esporádicos diagnosticados antes dos 40 anos. Foram identificadas variantes raras em heterozigotia neste gene em 18 (8,3%) doentes. No entanto, apenas quatro (1,8%) doentes apresentavam variantes patogénicas. Estas variantes compreendiam duas mutações já conhecidas (p.Arg81* e p.Leu115Trpfs*41) e duas mutações novas (p.Ser53Thrfs*36, e p.Glu246*). Estes quatro doentes tinham sido diagnosticados com somatotrofinoma em idades compreendidas entre os 14 e os 25 anos. A frequência de variantes patogénicas no gene AIP em doentes com idade inferior a 30 anos foi de 3,4% e com idade inferior a 18 anos foi de 5%, respetivamente. A frequência de mutações no gene AIP nesta coorte de doentes portugueses foi inferior à de outros estudos. A identificação de novas variantes no gene AIP expande o espetro das causas genéticas dos adenomas hipofisários e pode ajudar a compreender o papel das mutações neste gene nos mecanismos moleculares subjacentes à tumorigénese hipofisária. A terceira fase desta tese consistiu em identificar mutações germinativas num conjunto específico de 29 genes, descritos na literatura como tendo mutações germinativas em doentes com adenomas hipofisários, numa coorte de doentes portugueses diagnosticados com adenomas hipofisários esporádicos de início precoce. Para isso, foi feita a sequenciação completa do exoma em 225 doentes com macroadenomas hipofisários esporádicos diagnosticados até aos 40 anos de idade. Foram identificadas 154 variantes raras em 25 dos 29 genes. Destas foram identificadas três variantes patogénicas e 13 variantes provavelmente patogénicas, nos genes AIP, CDH23, MEN1, MSH2, PMS2, SDHB, TP53 e VHL, em 7,1% dos doentes. Nos doentes diagnosticados com idades inferiores a 30 e 18 anos, a frequência de mutações foi de 9,0% e 12%, respectivamente. Esta é, até à data, a maior análise multigénica de doentes com macroadenomas hipofisários esporádicos de início jovem. Confirmámos que o AIP é o gene mais frequentemente envolvido, mas também descobrimos causas genéticas mais raras de adenomas hipofisários, incluindo a primeira confirmação independente de um papel do gene CDH23. Na última fase desta tese foi avaliada a associação de três polimorfismos comuns próximos dos genes NEBL (rs2359536), PCDH15 (rs10763170) e CDK8 (rs17083838) à suscetibilidade a adenomas hipofisários esporádicos na população portuguesa. Foram determinadas as frequências genotípicas e alélicas de 570 casos e 546 controlos. O alelo minor CDK8 rs17083838 (alelo A) foi significativamente associado a adenomas hipofisários esporádicos. As variantes NEBL rs2359536 e PCDH15 rs10763170 não foram associadas a risco geral para a doença, embora tenha sido observada uma associação significativa entre o alelo minor PCDH15 rs10763170 (alelo T) e somatotrofinomas. Estes resultados sugerem que a variante CDK8 rs17083838, e possivelmente a variante PCDH15 rs10763170, podem aumentar a suscetibilidade a adenomas hipofisários esporádicos na população portuguesa. Concluindo, diferentes estratégias foram desenvolvidas e implementadas, ao longo desta tese, de forma a determinar quais os fatores de risco genético mais associados ao desenvolvimento de adenomas hipofisários esporádicos e familiares. Estes resultados são importantes sob o ponto de vista científico não só para uma melhor compreensão do panorama genético dos adenomas hipofisários, como também abrem portas para novas estratégias de rastreio genético direcionadas, oferecendo conhecimentos fundamentais para a gestão personalizada dos macroadenomas hipofisários de início precoce.
- iTRAQ Quantitative Proteomic Analysis of Vitreous from Patients with Retinal DetachmentPublication . Santos, F.M.; Gaspar, Leonor Isabel Mesquita ; Ciordia, Sergio; Rocha, Ana; Sousa, João Paulo Castro De; Paradela, Alberto; Passarinha, LA; Tomaz, C. T.Rhegmatogenous retinal detachment (RRD) is a potentially blinding condition characterized by a physical separation between neurosensory retina and retinal pigment epithelium. Quantitative proteomics can help to understand the changes that occur at the cellular level during RRD, providing additional information about the molecular mechanisms underlying its pathogenesis. In the present study, iTRAQ labeling was combined with two-dimensional LC-ESI-MS/MS to find expression changes in the proteome of vitreous from patients with RRD when compared to control samples. A total of 150 proteins were found differentially expressed in the vitreous of patients with RRD, including 96 overexpressed and 54 underexpressed. Several overexpressed proteins, several such as glycolytic enzymes (fructose-bisphosphate aldolase A, gamma-enolase, and phosphoglycerate kinase 1), glucose transporters (GLUT-1), growth factors (metalloproteinase inhibitor 1), and serine protease inhibitors (plasminogen activator inhibitor 1) are regulated by HIF-1, which suggests that HIF-1 signaling pathway can be triggered in response to RRD. Also, the accumulation of photoreceptor proteins, including phosducin, rhodopsin, and s-arrestin, and vimentin in vitreous may indicate that photoreceptor degeneration occurs in RRD. Also, the accumulation of photoreceptor proteins, including phosducin, rhodopsin, and s-arrestin, and vimentin in vitreous may indicate that photoreceptor degeneration occurs in RRD. Nevertheless, the differentially expressed proteins found in this study suggest that different mechanisms are activated after RRD to promote the survival of retinal cells through complex cellular responses.
- Refinement of two-dimensional electrophoresis for vitreous proteome profiling using an artificial neural networkPublication . Santos, Fátima Raquel Milhano dos; Albuquerque, Tânia Gonçalves; Gaspar, Leonor Isabel Mesquita ; Dias, Joao ML; Sousa, João Paulo Castro De; Paradela, Alberto; Tomaz, C. T.; Passarinha, LADespite technological advances, two-dimensional electrophoresis (2DE) of biological fluids, such as vitreous, remains a major challenge. In this study, artificial neural network was applied to optimize the recovery of vitreous proteins and its detection by 2DE analysis through the combination of several solubilizing agents (CHAPS, Genapol, DTT, IPG buffer), temperature, and total voltage. The highest protein recovery (94.9% ± 4.5) was achieved using 4% (w/v) CHAPS, 0.1% (v/v) Genapol, 20 mM DTT, and 2% (v/v) IPG buffer. Two iterations were required to achieve an optimized response (580 spots) using 4% (w/v) CHAPS, 0.2% (v/v) Genapol, 60 mM DTT, and 0.5% (v/v) IPG buffer at 35 kVh and 25 °C, representing a 2.4-fold improvement over the standard initial conditions of the experimental design. The analysis of depleted vitreous using the optimized protocol resulted in an additional 1.3-fold increment in protein detection over the optimal output, with an average of 761 spots detected in vitreous from different vitreoretinopathies. Our results clearly indicate the importance of combining the appropriate amount of solubilizing agents with a suitable control of the temperature and voltage to obtain high-quality gels. The high-throughput of this model provides an effective starting point for the optimization of 2DE protocols. This experimental design can be adapted to other types of matrices. Graphical abstract.
- Proteome analysis of vitreous humor in retinal detachment using two different flow-charts for protein fractionationPublication . Gaspar, Leonor Isabel Mesquita ; Santos, F.M.; Albuquerque, Tânia; Sousa, João P. Castro de; Passarinha, L A; Tomaz, Cândida T.The deeper understanding of retinal detachment (RD) pathogenesis may improve the visual outcome after surgery. Given the main role of the vitreous in retinal eye diseases, two strategies were explored to identify its proteome in RD. Fractionation techniques such as anion exchange chromatography (IEX) and SDS-PAGE combined with MALDI-TOF/TOF analysis allowed to identify 127 proteins in vitreous of RD patients. From these proteins, 19 were identified using only the IEX fractionation strategy, and 117 using a bidimensional (IEX and SDS-PAGE) fractionation. Of these proteins, 68 had not yet been found in other vitreous proteomic studies. The fractionation with IEX and SDS-PAGE largely improved the number of identified proteins proving that it is crucial to combine several methodologies to cover vitreous proteome.
- Proteomic analysis of the human vitreous humor in Retinal DetachmentPublication . Gaspar, Leonor Isabel Mesquita ; Santos, Fátima Raquel Milhano dos; Tomaz, Cândida Ascensão TeixeiraOver the past few years, there has been an intensification in onset of ocular diseases among worldwide population. The incidence of eye pathologies upsurges with advancing age, leading to a decline of normal eye function and even to blindness. Ocular diseases are frequently triggered by chronic disorders, such as diabetes or hypertension, or by alterations in retinal positioning, which occurs in retinal detachment (RD). Recent studies indicates that human vitreous humor (VH) suffers proteome alterations according to the actual physiological and pathological state of the retina. However, there are few published articles regarding RD proteome. Hence, this study is focused in the proteomic analysis of VH samples in RD and posterior identification of the present proteins in these samples, as well as to understand in what way they are connected and how they act. In this way, we can get access to the VH proteome in RD patients, which is our main goal. To achieve these goals, several strategies were combined, including high abundant proteins depletion, protein fractionation and analysis by mass spectrometry (MS), in order to maximize the number of identified proteins. The final optimized strategy combined protein fractionation using liquid chromatography (LC), SDS-PAGE, and protein identification by MALDI-TOF/TOF. Using this methodology, we found 236 proteins with a 95% confidence, using ProteinPilot, where 46 proteins share common biological associations, with a minimum score of 0.900 according to STRING10. The majority of these 46 proteins are involved in regulation processes and share binding functions. Simultaneously, the same VH group sample was analyzed by LC and MALDI-TOF/TOF, in order to understand the importance of the implementation of SDS-PAGE in the process. Thus, we verified that with LC-MALDI only 110 proteins were identified. In conclusion, the developed strategy allowed to find proteins which were not identified using other proteomic strategies.