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- Avaliação de Cianinas como Potenciais Agentes Antiproliferativos para o Tratamento do CancroPublication . Maia, Ana Alexandra Fernandes; Silvestre, Samuel Martins; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Serrano, João Paulo LourençoAtualmente, o cancro é uma das doenças com maior incidência a nível mundial. O crescimento populacional, assim como o elevado envelhecimento, associados a fatores ambientais de risco e a fatores genéticos, têm contribuído para o agravamento das taxas de morbilidade e mortalidade. Todavia, nos dias de hoje, existem variados tratamentos associados a esta doença, encontrando-se entre os mais importantes, a quimioterapia, a radioterapia e a terapia fotodinâmica. A aplicação adequada destas terapias, em conjunto com um diagnóstico atempado e eficiente, aumentam significativamente as probabilidades de cura dos pacientes. Dentro da terapia fotodinâmica, as cianinas têm sido amplamente testadas nos últimos anos. Estas são corantes constituídos por dois anéis heterocíclicos unidos por uma cadeia metínica com um número ímpar de carbonos. Ao longo dos anos estes compostos têm sido aplicados em áreas distintas da ciência, sendo utilizados como agentes fotossensíveis e agentes antiproliferativos. Este trabalho de dissertação tem como objetivos principais a síntese e a caracterização espectroscópica de novas monometinocianinas com potencial anticancerígeno e a correspondente avaliação biológica in vitro, nomeadamente, do seu potencial antiproliferativo em diversas linhas celulares, assim como estudos adicionais de microscopia de fluorescência e, ainda, estudos computacionais complementares. Na síntese de monometinocianinas realizada neste trabalho obtiveram-se rendimentos moderados a bons, sendo que os melhores resultados foram obtidos na síntese das monometinocianinas assimétricas (72% e 68%). No screening inicial realizado a uma concentração de 10 µM selecionaram-se as cianinas que apresentaram um maior potencial antiproliferativo e que demonstraram ter seletividade para as células cancerígenas. Após essa seleção, procedeu-se à realização do cálculo da metade da concentração inibitória máxima (IC50). Dos sete compostos testados, destaca-se uma das monometinocianinas com elevado potencial anticancerígeno, especialmente na linha celular Caco-2 (IC50= 0,01 µM) e seletividade para esta linha celular cancerígena. No entanto, serão necessários mais estudos biológicos neste contexto, de forma a elucidar o seu mecanismo de ação e a respetiva localização celular.
- Desenvolvimento de criogéis funcionalizados com barbituratos para a purificação de uma vacina de DNA plasmídico contra o InfluenzaPublication . Martins, Andreia Segura Pinheiro; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Tomaz, Cândida Ascensão TeixeiraO vírus influenza é a causa de uma doença respiratória grave, comummente chamada de gripe, de elevada transmissibilidade e distribuição global e que provoca elevados níveis de mortalidade por todo o mundo. A melhor opção para travar esta doença viral e contagiosa é a vacinação. Apesar das vacinas da gripe convencionais, baseadas na tecnologia de ovos de galinha embrionados, serem normalmente eficazes, apenas conferem proteção contra as estirpes dominantes de cada ano e têm um risco zoonótico associado. Deste modo, são produzidas anualmente novas vacinas para antecipar as estirpes circulantes do vírus, processo que leva meses até estar concluído. As vacinas de DNA, baseadas na tecnologia do DNA recombinante, são uma alternativa promissora relativamente à vacinação convencional uma vez que são efetivas, e têm um processo de produção genérico e fácil de transpor para larga escala, em oposição ao complexo processo de produção associado às vacinas convencionais. Esta terapêutica consiste na expressão de um plasmídeo com os genes que codificam os antigénios de interesse num hospedeiro apropriado, permitindo a sua produção in vivo. No entanto, as vacinas de DNA requerem uma grande quantidade e com elevado grau de pureza, da isoforma superenrolada do DNA plasmídico biologicamente ativa. A cromatografia tem sido a técnica de escolha na purificação do pDNA por ser reprodutível, fiável e fácil de transpor para larga escala. No entanto, as matrizes convencionais usadas para este fim apresentam algumas limitações como as suas baixas propriedades de transferência de massa e baixa capacidade de ligação para moléculas maiores com o pDNA. Neste sentido, os criogéis podem ser utilizados no processo downstream por serem uma boa alternativa às matrizes cromatográficas convencionais, devido aos seus poros grandes e interconectados, boa difusibilidade e capacidade de ligação entre a molécula alvo e o suporte. O ácido barbitúrico, bem como os seus análogos tio- e/ou N,N-di-substituídos podem ser facilmente ligados aos criogéis ativados com grupos epóxido fazendo uso da bem descrita reatividade nucleofílica do C-5 na forma de enol ou enolato. Deste modo, foram preparados suportes cromatográficos baseados em criogéis derivatizados em condições acídicas e utilizando ligandos barbitúricos representativos como o ácido barbitúrico, tiobarbitúrico e 1,3-difenil-2-tiobarbitúrico, com diferentes concentrações de ligando. Assim, no presente trabalho de investigação, foi testada a purificação do pDNA NTC 7482-41H-VA2 HA com 6.471 kbp que codifica a glicoproteína antigénica de superfície do vírus influenza, hemaglutinina, utilizando suportes de criogéis derivatizados com barbituratos. Para isto, foram quimicamente sintetizadas colunas de criogel com diferentes densidades de ligando. Inicialmente, foi estudado o perfil de retenção e eluição bem como a separação da isoforma superenrolada do pDNA da isoforma circular aberta, com base nas diferentes matrizes sintetizadas, sendo a coluna de criogel com ácido 1,3-difenil-2-tiobarbitúrico com 5,0 mg/mL, aquela que demonstrou os melhores resultados, sendo por isso a escolhida para os estudos posteriores de separação de isoformas. Este suporte foi explorado através da manipulação de diferentes concentrações de sal e valores de pH, nos equipamentos cromatográficos Flash Protein Liquid Chromatographic e ÄKTA Purifier, numa tentativa de separar a isoforma superenrolada do pDNA como exigido pelas agências reguladoras. A melhor estratégia de separação das isoformas consistiu na aplicação de um gradiente crescente de cloreto de sódio usando 10,0 mM de tampão acetato de sódio com pH 5,0 como passo de ligação, e uma estratégia de eluição por dois passos usando o mesmo tampão com 0,550 M, seguido de 1,0 M de cloreto de sódio, que resultou numa separação parcial das isoformas sc e oc do pDNA do amostra pré-purificada. Na amostra de lisado, a utilização de 10,0 mM de tampão acetato de sódio com pH 5,0 como passo de ligação, e uma estratégia de eluição por dois passos usando o mesmo tampão com 0,263 M, seguido de 2,500 M de cloreto de sódio promoveu a separação da isoforma superenrolada do DNA do RNA, proteínas e outras impurezas com 65,60 % de pureza e um grau de recuperação de 88,0 %. Os resultados obtidos demonstram a aplicabilidade dos criogéis de ácido 1,3-difenil-2-tiobarbitúrico com 5,0 mg/mL na separação e purificação das vacinas de pDNA contra o vírus influenza por cromatografia de afinidade.
- Desenvolvimento de heterociclos pirimidínicos derivados de ácidos barbitúricos, como potenciais inibidores da xantina oxidasePublication . Figueiredo, Joana Patrícia Rodrigues; Silvestre, Samuel Martins; Almeida, Paulo Jorge da SilvaO desenvolvimento da biologia molecular e da química computacional entre outras áreas levou ao isolamento e caraterização de diversos alvos biológicos, sendo a xantina oxidase um destes casos. Esta enzima chamou a atenção dos químicos medicinais, uma vez que o aumento da sua atividade conduz a estados patológicos graves. A xantina oxidase é uma importante e versátil molibdoflavoproteina, envolvida no metabolismo de purinas, que catalisa a transformação da hipoxantina em xantina e da xantina em ácido úrico, com concomitante produção de espécies reativas de oxigénio. Além disso, níveis elevados de ácido úrico podem levar à gota, uma doença geralmente controlada utilizando o fármaco alopurinol, que é considerado o inibidor protótipo desta enzima. No entanto, a utilização deste fármaco na clínica está associada a efeitos adversos relevantes, o que levou ao desenvolvimento de novos inibidores. Os barbituratos constituíram, ao longo dos anos uma estrutura base importante para o desenvolvimento de novos fármacos, sendo as modificações no anel pirimidínico, em especial, alterações em C-5, as mais relevantes na descoberta de novas moléculas bioativas. Com este trabalho de dissertação, e com o objetivo de se obterem análogos ao alopurinol, pretendia-se a síntese de novos barbituratos ciclizados em C-5-C-6 do anel pirimidínico. Não se confirmando a ciclização pretendida, optou-se por realizar modificações ao anel pirimídico em C-5, obtendo-se derivados de hidrazinilpirimidinas, descritos com diversas atividades biológicas. Após a caraterização estrutural dos compostos sintetizados foram testadas as suas atividades biológicas, avaliando-se as suas capacidades de inibição da atividade da enzima xantina oxidase, e o seu potenciai anti-oxidante, anti-bacteriano e anti-proliferativo, numa linha celular do cancro da mama e numa linha celular normal. Adicionalmente, foram realizados estudos complementares in silico, nomeadamente estudos de docking molecular e de previsão de propriedades farmacocinéticas. Dos resultados obtidos, destaca-se o potencial de inibição da atividade da enzima xantina oxidase de duas hidrazinilpirimidinas, tal como a capacidade de outros destes compostos como anti-oxidantes e anti-bacterianos, sendo estes últimos resultados bastantes promissores.
- Docking, síntese e avaliação citotóxica de novos análogos da nimesulida como potenciais agentes anticancerígenosPublication . Catarro, Mafalda Incenso Pereira; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Silvestre, Samuel MartinsA nimesulida é um anti-inflamatório não esteroide, tendo também propriedades analgésicas e antipiréticas. Vários estudos demonstraram a sobreexpressão da enzima ciclooxigenase-2 em cancros sólidos, estando esta associada nomeadamente à produção da prostaglandina-E2, a qual potencializa a carcinogénese. Uma vez que a nimesulida e os seus análogos, bem como outros fármacos, inibem a ciclooxigenase-2, é expectável que apresentem propriedades anticancerígenas. Recentemente, várias orto-(alquilcalcogénio)-N-acetanilidas estruturalmente semelhantes à nimesulida foram sintetizadas e foi avaliada a sua potencial atividade anticancerígena. De facto, em estudos in vitro de proliferação celular apresentam atividade antiproliferativa seletiva para células cancerígenas, destacando-se as células do adenocarcinoma da próstata sensíveis a androgénios. Os compostos mais potentes foram as acetanilidas O- e/ou N-benzilícas e -hexílicas. Desta forma, tendo em conta os grupos já conhecidos de análogos da nimesulida que potenciam a atividade anticancerígena, foi sintetizada e caracterizada uma nova série de orto-(alquiltio)-N-alquilacetanilidas. Nesta série destaca-se a introdução dos grupos nitro e acetamida na posição 4 das acetanilidas e os grupos ligados ao grupo tio e/ou amida [hexilo, metilenociclohexilo e (2,4-dimetilbenzilo)]. Adicionalmente, foram avaliados os seus efeitos na viabilidade celular de fibroblastos normais da derme humana, em células do adenocarcinoma da próstata sensíveis a androgénios e em células epiteliais humanas do cancro da mama sensíveis a estrogénios. Os resultados obtidos confirmam que as acetanilidas desenvolvidas neste trabalho de dissertação são potenciais agentes anticancerígenos para o cancro da mama, realçando-se as acetanilidas com protão na posição 4 com grupos N- e S-hexílicos e a acetanilida com grupo acetamida na posição 4 e com grupo N-hexílico e S-(2,4-dimetilbenzílico). Os estudos de docking molecular foram realizados de forma a avaliar as energias de ligação e as possíveis interações com a ciclooxigenase-2, aromatase, recetor de androgénios e recetor alfa de estrogénios. Os resultados demonstraram que as acetanilidas podem ser potenciais inibidores da aromatase, e ligar-se a recetores de androgénios e a recetores alfa de estrogénios, embora não apresentem afinidade significativa para a ciclooxigenase-2.
- Funcionalização de criogéis para purificação cromatográfica de DNA plasmídicoPublication . Brito, Andreia Sofia Costa; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Tomaz, Cândida Ascensão TeixeiraA cromatografia é uma poderosa ferramenta preparativa e analítica e um dos métodos de purificação mais importantes aplicados em processos “downstream” no ramo da Biotecnologia. A cromatografia de afinidade é uma das técnicas de eleição na purificação de DNA plasmídico (pDNA), sendo o ligando usado um dos fatores principais para o sucesso do processo. A purificação cromatográfica de pDNA requer suportes altamente porosos devido ao seu alto peso molecular e à elevada viscosidade das suas soluções. Os criogéis são materiais poliméricos macroporosos com canais interconectados, sendo uma alternativa aos suportes particulados convencionais na purificação de pDNA. O 3,8-diamino-6-fenilfenantridina (DAPP) e o tosilato de 5-pent-4-en-1-il-fenantridínio são ligandos de origem sintética e apresentam na sua estrutura um braço espaçador e carga positiva, o que os torna potencialmente adequados para a imobilização num criogel usando e o metacrilado de 2-hidroxietilo (HEMA) como co-monómero, para posteriores estudos cromatográficos. Neste projeto, foram testados dois métodos de imobilização do ligando à matriz e dois suportes de controlo. Foram efetuados vários ensaios cromatográficos, de retenção e de separação das isoformas superenrolada (sc) e circular aberta (oc) de pDNA. Adicionalmente, testou-se a separação da isoforma sc a partir de uma amostra de lisado clarificado. Os resultados mostram que o DAPP (5 mg/mL) e o HEMA são os ligandos com melhores perfis de retenção sendo por isso escolhidos para os estudos de separação de isoformas. Tanto o DAPP como o HEMA mostraram seletividade para a isoforma sc usando como passo de ligação uma solução tampão de acetato de sódio 10 mM pH 5,0 e como passo de eluição, tampão acetato de sódio 10 mM pH 5,0 na presença de NaCl. Quanto à amostra de lisado clarificado, apenas o HEMA revelou capacidade de separação da isoforma sc dos contaminantes RNA e proteínas. Estes estudos iniciais permitiram demonstrar o potencial da aplicabilidade de criogéis com ligandos sintéticos para a separação e purificação de pDNA por cromatografia de afinidade.
- A Microwave Assisted Optimization of New Spiroindolin-3-one(thio)barbituratesPublication . Soeiro, Pedro António Fantini; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Boto, Renato Emanuel FelixMedicinal Chemistry is a scientific area centered in the discovery and development of new bioactivated chemical entities. In recent years, a high interest in the synthesis of C5-substituted barbiturates, with various biological activities, has been shown. 5-(Benzisoxazol-3-ylidene) (thio)barbiturates, owning a 2,1-benzisoxazole, are one of these examples. 2,1-Benzisoxazoles are a class of compounds mainly known as precursors of other bioactive molecules such as quinolines, acridines, quinazolines and benzodiazepines. These transformations may be due to thermal cleavage of the N-O bond of the isoxazole nucleus, where the formation of a spiro, more precisely a spiroindolin-3-one, was postulated as an intermediate. Spiro compounds are composed of two or more cyclic structures fused to a single carbon. The tetrahedral nature of this carbon allows the formation of a perpendicular angle between the rings, which provides a unique rigid and three-dimensional conformation for these compounds, presenting different implications in various biological activities. In the present work, novel spiroindolin-3-one(thio)barbiturates have been developed. Their synthesis was subjected to an optimization of reactional conditions, varying the temperature and the solvent used, and using different methods of heating (oil bath, muffle, heating lamp and microwave). All compounds were synthetized with very good yields (70-85%) and were structurally characterized by nuclear magnetic resonance and infrared spectroscopy. Additionally, their effect in cell viability and xanthine oxidase inhibitory activity was evaluated, and, for a better understanding of the in vitro results, in silico studies were also realized. Generally, none spiroindolin-3-one(thio)barbiturates showed relevant cytotoxicity in the studied cell lines nor any relevant xanthine oxidase inhibitory activity. Further synthesis of new analogues is highly important for an optimization of the biological results, and for a better understanding of their respective structure-activity relationship. It is also of great importance the synthesis of new asymmetric spiroindolin-3-one(thio)barbiturates, as well as the separation of their enantiomers, to determine the individual biological activity of each one.
- New Steroidal Arylidene Derivatives Potentially Useful in the Treatment of Prostatic DiseasesPublication . Brito, Vanessa Sofia Figueiredo de; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Silvestre, Samuel Martins; Alves, Gilberto LourençoThe prostate is a male-specific hormone-responsive gland with a crucial role in the male reproductive system and requires androgenic hormones and an androgen receptor (AR) for proper growth and development. Generally, this gland is mainly affected by three pathologies, namely prostatitis, benign prostatic hyperplasia (BPH), and malignant prostate cancer (PCa). These disorders constitute a source of significant morbidity and mortality for men worldwide. Thus, pharmacological therapy's relevance in managing these prostatic disorders is unquestionable. Currently, it is well established that the importance of steroidal hormones in the pathophysiology of BPH and PCa. In this context, it is known that the abnormally high 5α-reductase (5AR) activity in humans results in excessively high 5α-dihydrotestosterone (DHT) levels in peripheral tissues, which have been mainly implicated in the pathogenesis of BPH and PCa. Therefore, the role of DHT had contributed to the interest in finding 5AR inhibitors (5ARIs), comprising an important and commonly applied strategy principally in the treatment of BPH. Considering the unmet medical need, it is recognized that the 5ARIs clinically used, such as finasteride, exhibit low potency and several adverse side effects that significantly reduce the quality of life of patients. Furthermore, the effect of these drugs in the PCa treatment is controversial, although it seems a valid and logical approach to explore. In this context, arylidenosteroids, a class of modified steroids, have been reported with important antiproliferative activity and also with potential 5AR inhibitory activity. In the present work, the preparation of novel steroidal arylidene derivatives potentially useful in prostatic diseases, displaying inhibitory capacity against 5AR and/or antiproliferative properties against tumoral cells was intended. Essentially, this thesis aimed the discover of hit compounds for further development in the context of BPH and PCa. To achieve this goal, different synthetic strategies were exploited and new series of steroidal arylidene derivatives were obtained, and their antitumoral and 5AR inhibitory activities were evaluated. Moreover, molecular docking simulations against important targets of steroidal molecules, 5AR type 2, estrogen receptor α (ERα), AR, steroid 17α-hydroxylase/17,20 lyase (CYP17A1), and aromatase, were performed to understand the possible affinity and interactions. This thesis also contemplates the conclusion of the biological evaluation of arylidene-4-azasteroids (VB 4a-g and VB 7a-g) synthesized at the Master’s project and a comprehensive three-dimensional quantitative structure-activity relationship (3D-QSAR study considering the antiproliferative activity in prostate cells, since this work fits into the context of this thesis. In relation to this last part, robust 3D-QSAR models generated to elucidate the relation of the proliferation of LNCaP (androgen-dependent) and PC-3 (non-androgen dependent) cells and the structure of tested compounds showed the importance of the presence of bulky groups and electronegative atoms. Concerning the doctoral project, after several failed attempts to prepare new 3-,4- and 6-azasteroids modified at D-ring with fused/attached heterocycles, a new synthetic strategy was studied and applied and three distinct series of novel arylidene oxidized steroids were successfully obtained from dehydroepiandrosterone. The chemical structures and high purity of the new 16E-arylidene-5α,6α-epoxyepiandrosterone, 16E-arylidene-3β,5α,6β-trihydroxyandrosten-17-one, and 16E-arylidene-androst-4-ene-3,6,17-trione derivatives were corroborated by melting point determination, infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance spectroscopy, and high-resolution mass spectroscopy. Then, to determine their antitumoral potential, the activity of all synthesized analogs over the viability of tumoral cells was evaluated against several human tumoral and non-tumoral cell lines were assessed by (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The effect of compounds on cell proliferation was evaluated against prostate cancer androgen-dependent cells (LNCaP), prostate cancer non-androgen dependent cells (PC-3), breast cancer cell line (MCF-7), normal prostate epithelium cells (PNT1A), and normal human dermal fibroblasts (NHDF). Furthermore, preliminary studies of the mechanism of action of the most promising derivatives were performed in MCF-7, LNCaP, and PC-3 cell lines using techniques, such as immunocytochemistry, fluorescence microscopy, and caspase activity assessment. Lastly, the potential 5AR inhibitory activity of all compounds, including the arylidene-4-azasteroids synthesized during the Master’s project, were determined through testosterone quantification in mice liver microsomes by high-performance liquid chromatography coupled to a diode array detector (HPLC-DAD). This method was previously adapted, partially developed and validated, also in the context of the present project. Moreover, from the results of this assay, the main interactions of the best compounds against 5AR type 2 was also evaluated in the attempt of understanding the structure-activity relationship. Several of these new steroidal derivatives exhibited an interesting growth-inhibition effect on human tumoral cells, and generally, these tested compounds revealed to be less cytotoxic to non-tumoral cells producing higher IC50 values. The most relevant reduction of cell proliferation was observed with compounds VB 9e in MCF-7 cells (IC50= 3.47μM), VB 10e in PC-3 cells (IC50= 6.96 μM), and VB 11c in LNCaP cells (IC50= 6.48 μM). Moreover, the determined IC50 values of these compounds are very similar to the positive control, 5-fluouracil (5-FU). Additional biological studies showed that steroidal derivatives VB 9e and VB 11c seemed to trigger apoptosis in MCF-7 and LNCaP cells, respectively. VB 9e caused significant alterations in Ki67 (↓) and propidium iodide (↑) staining and modifications in nuclear morphology and cell distribution analysis in MCF-7 cells. On the other hand, VB 11c caused the same morphological and cell distribution alterations, and also seemed to increase the activity of caspase-3/7 in the LNCaP cell line. Molecular docking studies showed that these new derivatives presented stronger affinity to 5AR type 2 and CYP17A1, and poor affinity to ERα and AR. Relative to aromatase, it was verified higher affinity for steroidal 4-ene-3,6,17-triones. To finish, the effect of the steroidal arylidene derivatives on 5AR activity and the main results revealed that compound VB 11c seemed to be the most potent inhibitor (IC50= 6.12 nM). In addition, the in silico interactome study was performed and it was observed that this steroid displayed a higher number of interactions in common with finasteride, the reference, compared with other tested compounds. Interestingly, in this case, there is a correlation between in silico and experimental data. Taken together, the results showed that steroid VB 11c seemed to be the most promising molecule to be considered as a hit compound, presenting selectivity to tumoral prostate cells, potentially triggering the apoptotic cell death mechanism in the LNCaP cell line, and being the most potent against 5AR. In conclusion, the research work constitutes an important contribution to the knowledge concerning steroidal arylidene derivatives as agents with antiproliferative and 5AR inhibitory properties. Therefore, new paths were opened, showing the possibility of successfully developing potential new inhibitors based on steroid molecules for further development in the context of BPH and PCa.
- Uma nova via sintética para N-óxidos de quinolinaPublication . Reis, Melani Joana Almeida; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Silvestre, Samuel MartinsA química medicinal moderna tem-se mostrado fundamental no processo de descoberta e desenvolvimento de novos fármacos. Neste contexto, os N-óxidos de quinolina e as quinolinas têm despertado cada vez mais interesse aos químicos medicinais, uma vez que estes núcleos estão presentes em compostos bioativos, nomeadamente antibacterianos, antiparasitários, antimaláricos e anticancerígenos. No decorrer da investigação laboratorial conducente a esta dissertação, em que se pretendia generalizar a obtenção de novos benzoisoxazol-3-ilidenos anteriormente descrita para 5-(benzoisoxazol-3-ilideno)pirimidinas, verificou-se a formação inesperada de N-óxidos de quinolina durante a redução de 2-nitrobenzilidenos (cíclicos e acíclicos) e de 2-nitrofenilmetilenos. Neste contexto, é aqui proposta e desenvolvida uma nova via sintética que permite a formação seletiva de N-óxidos de quinolina. Assim, na presença de um agente redutor (SnCl2·2H2O), o grupo nitro é parcialmente reduzido, formando-se uma hidroxilamina intermediária, a qual permite uma ciclização intramolecular com posterior eliminação de água, originando assim o N-óxido de quinolina correspondente. Adicionalmente, 5-(benzoisoxazol-3-ilideno)pirimidinas, os N-óxidos e os precursores sintetizados foram testados in vitro como inibidores da xantina oxidase e foi avaliada a sua citotoxicidade numa linha celular do cancro da mama (MCF-7) e em fibroblastos normais da derme humana (NHDF). Dos resultados obtidos, destaca-se um dos precursores, 5,5'-((2-nitrofenil)metileno)bis(1,3-dietil-2-tioxodihidropirimidina-4,6(1H,5H)-diona) (7g), o qual apresenta um elevado potencial como inibidor da xantina oxidase (concentração inibitória a 50% = 6,1 µM). Assim, é necessária uma avaliação futura dos parâmetros cinéticos e mecanísticos de inibição desta enzima por parte deste composto, bem como a preparação de novos análogos para um melhor entendimento da respetiva relação estrutura-atividade. Relativamente aos estudos de citotoxicidade, destaca-se o (E)-3-(2-nitrofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (6j) o qual levou a uma baixa proliferação (2,4%) das células MCF-7 a 30 µM. A este dado acresce o facto de não apresentar marcada citotoxicidade em NHDF, mostrando-se seletivo para a linha tumoral estudada. Aos ensaios de avaliação in vitro acresceram estudos complementares in silico, nomeadamente estudos de docking molecular e de ADMET.
- Novel affinity chromatography processes for the purification of plasmid DNA using small aromatic moleculesPublication . Nunes, Catarina Caramelo; Tomaz, Cândida Ascensão Teixeira; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Marcos, João Carlos Ramos NunesMolecular therapies are gaining importance as an effective therapeutic approach for various types of diseases. The most efficient vectors used to introduce the therapeutic genes are of viral origin however, non-viral vectors based on pDNA are gaining popularity due to their superior safety and easy of production. These factors have increased the demand for high quantities of pharmaceutical grade plasmid DNA (pDNA). Therefore, the research for more efficient pDNA purification protocols has also increased. Moreover, the final pDNA product must meet stringent quality criteria established by the regulatory agencies. Liquid chromatography is the method of choice for the purification of pDNA, since it is simple, robust, versatile and high reproducible. The most important features of a chromatographic procedure are the use of suitable stationary phases and ligands. As conventional purification protocols are being replaced by more sophisticated and selective procedures, the focus changes towards designing and selecting ligands of high affinity and specificity. In fact, the chemical composition of the chromatographic supports determines the interactions established with the target molecules, allowing their preferential retention over the undesirable ones. With these facts in mind, the aim of this work was to develop new chromatographic methods for the purification of pharmaceutical grade pDNA, with the purpose of improving the overall procedures to more effective, simple, economic and environmental-friendly ones. The minor groove binder berenil and the intercalator 3,8-diamino-6-phenylphenanthridine (DAPP) where chosen to be used as ligands in pDNA chromatographic purification studies. They were immobilized to an epoxy-activated Sepharose matrix using a relatively mild curing method, without a catalyst and with quite small ligand:Sepharose weight ratios. Berenil binds pDNA preferentially through hydrophobic interactions but other types of interaction contributions cannot be neglected. It was shown to be quite effective at separating and purifying pDNA from clarified and non-clarified cell lysates, using three different approaches, although isoform resolution was not obtained in either case. Using mild amounts of ammonium sulphate in the eluent, berenil-Sepharose support was able to purify distinct pDNA of two different sizes from clarified cell lysates. Moreover, the ability was continual when the clarification process was replaced by a second chromatographic run. In all cases plasmid solutions were in accordance to the specifications of a pharmaceutical product, however the yields were quite different: two consecutive chromatographic runs lead to lower recoveries (33%) and smaller pDNA molecules have higher recoveries using one run through the column (85% vs 45%). A negative chromatography approach was also performed with berenil-Sepharose, showing some advantages in terms of salt usage as well as procedure time. In this case the recovery yield was quite good (87%) and although pDNA solutions had a comparable purity to that obtained with the other approaches, the gDNA reduction was not so effective. DAPP is slightly A-T specific and binds DNA through non-covalent, reversible stacking interactions of the condensed aromatic moiety into two successive base pairs, while the phenyl residue gets inserted into the minor groove. In addition, protonated DAPP molecules bind to DNA much strongly due to the generation of strong electrostatic interactions. Plasmid DNA binding to DAPP-Sepharose varies with pH and is affected by the presence of salt in the eluent. In fact, total retention of clarified lysate components was only possible with a pH below DAPP's free state pKa (5.8) and the presence of salt destabilizes that same retention. So, the elution of bound species was simply performed by adding small amounts of sodium chloride to the buffers. These features were successfully applied for purification of sc pDNA with two distinct sizes that were obtained according to the regulatory agencies specifications. Once more, the recovery yield of the smaller pDNA molecule was higher than the one obtained for the largest one (94% vs 65%). In conclusion, DAPP-Sepharose showed exceptional characteristics to be used as an affinity support for the purification of pharmaceutical grade sc pDNA. In comparison with berenil- Sepharose, it uses much smaller amounts of salt, with less economic and environmental impact, while improving the quality and yield of the obtained plasmid fractions. Moreover, it is able to separate sc pDNA from linear and oc isoforms even in complex lysates. Moreover, combining DAPP-Sepharose chromatography with other optimized production, extraction and clarification procedures, can offer a number of advantages for pharmaceutical pDNA purification. Also, since the most significant disadvantage of this DAPP-Sepharose support is the relatively low capacity for pDNA, which in turn is strongly related to the solid matrix used, other more stable stationary phases with low pressure drops and interconnected macropores, that allow a high mass transfer of solutes, are quite fascinating alternatives.
- Novos derivados espiroindolin-3-ona(tio) barbituratos com potencial atividade antimaláricaPublication . Manuel, Domingos Morais; Almeida, Paulo Jorge da Silva; Silvestre, Samuel Martinsmalária, doença causada por protozoários do género Plasmodium, é um grande problema de saúde pública para as chamadas nações do terceiro mundo, sendo uma das suas principais causas de morte. Existem mais de cento e cinquenta espécies de parasitas deste género, mas apenas cinco têm sido as responsáveis por esta doença em humanos, das quais se destacam, o Plasmodium falciparum, o Plasmodium vivax, o Plasmodium malariae, o Plasmodium ovale e o Plasmodium knowlesi. A malária é transmitida pelo mosquito fêmea do género Anopheles, tendo sido usados diversos tipos de estratégias para o combate deste mal, muitas delas ainda em uso, que incluem a eliminação do vetor, a farmacoterapia e a vacinação. No que concerne à farmacoterapia, têm sido usados ao longo dos anos vários fármacos, entre os quais os pertencentes à família das aminoquinolinas e dos aminoálcoois, os antibióticos e mais recentemente os endoperóxidos, dos quais se destacam a artemisinina e seus derivados. Recentemente, uma série de novos estudos revelaram que espiroindolin-2-onas possuem potente atividade antiplasmódica, atuando na fase sanguínea do ciclo de vida do parasita. Motivados por estes resultados, e a partir de uma nova via sintética conducente a novos espiroindolin-3-ona (tio)barbituratos, iniciou-se o presente trabalho aqui descrito pela triagem in silico via docking molecular de uma série representativa de novas espiroindolin-3-onas e respetivos derivados obtidos por substituição eletrofílica aromática, com a proteína falcipaina-2, responsável pela degradação da hemoglobina no vacúolo alimentar do parasita. Estes resultados revelaram que a maioria dos compostos testados possui a capacidade de efetuar interações por ponte de hidrogénio com os principais resíduos de aminoácidos do sítio ativo da falcipaina-2, isto é, a Cys42, a Gly83, a His174 e a Asn173. No seguimento desta primeira avaliação in silico, realizou-se a síntese e caracterização estrutural de uma série alargada de espiroindolin-3-ona (tio)barbituratos e seus derivados, a avaliação in silico mais completa incluindo docking molecular na proteína falcipaina-2 e a previsão de propriedades ADMET, e ainda a avaliação biológica in vitro em células NHDF para verificar a citotoxicidade dos compostos sintetizados. A partir dos estudos da atividade antiplasmódica a decorrer em colaboração, aguardam-se os resultados de forma a confirmar a potencialidade efetiva destes novos compostos como agentes antimaláricos. Adicionalmente avaliou-se enzimaticamente a capacidade destes mesmos compostos de inibirem a atividade da xantina oxidase. Os resultados da avaliação in silico mostraram que os derivados espiroindolin-3-ona (tio)barbituratos possuem grande potencial de ligação à proteína falcipaina-2 podendo efetuar ligações de hidrogénio com o resíduo de Cys42 do sítio ativo. Adicionalmente, os ensaios in vitro em células NHDF revelaram que os mesmos não apresentam uma citotoxicidade marcada nestas células normais. Por outro lado, o ensaio enzimático mostrou resultados bastante promissores: de facto, num screening a 30 µM, observou-se que dois derivados espiroindolin-3-ona barbituratos apresentaram capacidades inibitórias superiores às observadas com o alopurinol, o que foi posteriormente confirmado por estudos de concentração-resposta.