FC - DQ | Dissertações de Mestrado e Teses de Doutoramento
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Browsing FC - DQ | Dissertações de Mestrado e Teses de Doutoramento by advisor "Alba, Maria Eugénia Gallardo"
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- Aguardentes vínicas envelhecidas com diferentes tecnologiasPublication . Vitória, Cláudia Adriana Fernandes; Caldeira, Ilda Maria Justino; Anjos, Ofélia Maria Serralha dos; Alba, Maria Eugénia GallardoA aguardente vínica envelhecida é uma bebida com elevado teor alcoólico obtida através da destilação do vinho com posterior envelhecimento em contacto com madeira. Este envelhecimento é tradicionalmente realizado em vasilhas de madeira. Contudo, o uso de vasilhas envolve um processo moroso e dispendioso. Assim, começaram a surgir sistemas de envelhecimento alternativos para colmatar esta necessidade de tornar o processo mais sustentável. O destilado de vinho, a madeira utilizada no envelhecimento e todas interações existentes ao longo do processo de produção da aguardente são a fonte dos compostos voláteis odorantes que tornam a aguardente uma bebida com elevada complexidade aromática. Este trabalho consistiu em compreender se o uso de diferentes sistemas de envelhecimento (tradicional – vasilha de madeira; ou alternativo – garrafões de vidro com aduelas mergulhadas e com diferentes níveis de microxigenação), diferentes madeiras (castanheiro ou carvalho Limousin) e/ou tempo de conservação em garrafa têm influência no aroma da aguardente vínica Lourinhã. A influência no aroma foi avaliada pela análise dos compostos voláteis com recurso a cromatografia de gases acoplada à espetrometria de massa (GC-MS) e cromatografia de gases acoplada a um detetor de ionização de chama (GC-FID) e pela análise sensorial recorrendo a um painel de provadores e realizando uma análise descritiva quantitativa. Os resultados corroboraram estudos anteriores acerca do uso do sistema alternativo e/ou da madeira de castanheiro serem uma boa opção no envelhecimento de aguardentes e estuda, pela primeira vez, a evolução desta bebida em garrafa, comprovando uma melhoria do aroma durante a conservação em garrafa.
- Aplicação de dried blood spots na deteção e quantificação de canabinóides por cromatografia de gases/espectrometria de massas em tandemPublication . Caetano, Mariana Nogueira; Alba, Maria Eugénia GallardoA canábis é a droga ilícita mais comum e mais consumida mundialmente, como tal, é importante contribuir para o desenvolvimento de metodologias que tornem os laboratórios mais eficazes na identificação e quantificação desta substância psicoativa. O objetivo deste trabalho de investigação foi o desenvolvimento e validação de um método analítico por cromatografia de gases associada à espectrometria de massas em tandem (GS/MS-MS) e Dried Blood Spots (BDS) para a determinação e quantificação de delta-9-tetrahidrocanabinol, 11-hidroxi-delta-9-tetrahidrocanabinol e 11-nor-9-carboxi-delta-9-tetrahidrocanabinol em amostras de sangue. É de salientar que é a primeira vez que estes compostos são determinados por DBS e GS/MS-MS. Os fatores que podiam influenciar o processo de extração foram avaliados: tipo de solvente de extração (metanol, acetonitrilo, diclorometano, 2-propanol, hexano e acetato de etilo), volume de solvente de extração (2 a 5 mL), tempo de extração (10 a 60 min), tempo de centrifugação (10 a 30 min) e tempo de secagem da mancha de sangue (3h a overnight). As condições finais são as seguintes: aplicar 100 µL de sangue em cartões Whatman® Human ID Bloodstain Card e deixar secar durante 6h; após este tempo, a mancha que contém a amostra é retirada do cartão e são adicionados 4 mL de metanol. O processo de extração é efetuado sob agitação durante 40 min. Finalizado este tempo procede-se à remoção do cartão. A amostra é centrifugada durante 20 min a 3000 rpm, e o sobrenadante evaporado e derivatizado com MSTFA/TMCS num micro-ondas a 800W durante 2 min. O método foi validado seguindo critérios internacionalmente aceites e os parâmetros estudados incluíram linearidade, seletividade, limites de deteção (LOD) e quantificação (LLOQ), precisão e exatidão. A seletividade foi avaliada e não foram observadas interferências procedentes de substâncias endógenas ou de outras drogas eventualmente presentes nos diferentes tempos de retenção e iões dos analitos em estudo. O procedimento foi linear para o intervalo de concentrações de 1 até 30 ng/mL, com coeficientes de determinação superiores a 0,99 para todos os analitos. As precisões intra- e inter-dia foram tipicamente inferiores a 15% para todos os analitos. Os LODs foram de 1 ng/mL para todos os compostos e as recuperações variaram entre 14% e 88%. O método validado mostrou ser aplicável à análise de amostras reais, sendo então uma ferramenta vantajosa não só no âmbito de análises de toxicologia clínica e forense, mas também em análises de despistagem de consumo de canábis.
- Aplicação de dried saliva spots na determinação de marcadores de consumo de tabacoPublication . Marques, Hernani Fortunato; Rosado, Tiago Alexandre Pires; Alba, Maria Eugénia Gallardo; Passarinha, Luís António PaulinoExposure to tobacco smoke is one of the most common causes of premature death worldwide and is the cause of 8 million deaths annually. For this purpose, it was developed, optimized, and validated a procedure for the detection of nicotine, cotinine and trans-3-hydroxycotinine (biomarkers of tobacco exposure) in oral fluid using the dried saliva spots sampling approach and gas chromatography coupled to tandem mass spectrometry, thus allowing the distinction between active and passive smokers. For optimization, 4 parameters were evaluated, namely extraction solvent, extraction solvent volume, extraction time and spots drying time. During method validation, the parameters selectivity, linearity, precision and accuracy, recovery, stability, and dilution factor were assessed. Linearity was obtained for all target analytes in the concentration range of 10-200 ng/mL allowing the quantification of compounds up to 1000 ng/mL considering the dilution factor. The method recoveries ranged from 29.2% to 43.30% for nicotine, 66.60% to 89.10% for cotinine and 80.30% to 92.80% for trans-3-hydroxycotinine, while achieving intra-day, inter-day and intermediate precision and accuracy values never greater than 10.37% and ± 6.50% respectively for all compounds. The herein described analytical method is the first that allows the determination of tobacco biomarkers in oral fluid using dried saliva spots, being considered a sensitive, simple, and low-cost alternative to conventional methods.
- Application of dried blood spots for the determination of organophosphorus pesticides by GC-MS/MSPublication . Soares, Sofia Pires Seixo; Barroso, Mário Jorge Dinis; Alba, Maria Eugénia GallardoThe uncontrolled use of pesticides, for instance of organophosphorus nature, is an issue that has been affecting societies for a long time. As this is a current subject, and the access to these compounds is so facilitated, legislation has been put in place to monitor their use; furthermore, these compounds still appear in intoxication statistical data, and as such their detection and quantification in biological specimens is still requested to many laboratories, mainly in the clinical and forensic areas. The objective of this work was to develop and validate an analytical method for the detection and quantification of five organophosphorus pesticides (diazinon, chlorpyrifos, parathion-ethyl, chlorfenvinphos and quinalphos) in blood, using the dried blood spots (DBS) sampling approach for sample preparation and gas chromatography coupled to tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). The internal standard used was ethion (ETH), and the entire extraction process was previously optimized. The developed method was fully validated according to internationally accepted guidelines for bioanalytical method validation, and the studied parameters included selectivity, linearity, limits of detection (LOD) and quantification (LLOQ), precision and accuracy, stability, dilution integrity, and recovery. Linearity was obtained in the range of 0.1-25 µg/mL for all compounds, except for diazinon (0.05-25 µg/mL) and quinalphos (0.25-25 µg/mL), with determination coefficients greater than 0.99. Intra- and interday precision revealed coefficients of variation (CVs) typically lower than 14%, while accuracy was within a ±12% interval from the nominal concentrations. Short-term stability (for 24h at room temperature), stability after 3 freeze/thaw cycles and long-term stability were studied, revealing that the analytes were stable under those conditions. Despite the low recoveries obtained (between 1 and 12%), the method was sensitive enough as to present limits of detection between 0.05 and 0.1 µg/mL. This is the first technique described using this extraction approach for these compounds, and its simplicity, sensitivity and speed allow its routine use in the laboratories for the detection and quantification of these organophosphorus pesticides in biological specimens.
- Assessment of pipette-tip magnetic solid phase extraction for determination of sulfonamides in waterPublication . Medina, Maxell Rafael Rodriguez; Bernardo, Francisco Javier Guzmán; Alba, Maria Eugénia GallardoThe widespread use of sulfonamides, in the population, in hospitals and veterinary medicine has raised concerns about the discharge of these compounds to the environment. The common treatments in wastewater, treatment plants cannot remove these compounds efficiently, which makes them end up in the water bodies, with concerning associated problems such as bacterial resistance. Therefore, it is essential to develop analytical methods that are both sensitive and selective to monitor and determine these compounds in water. A crucial step in the analytical process is the sample preparation, which allows its purification and concentration. Solid phase extraction (SPE) is a commonly used technique for this purpose, but it has several drawbacks such as associated costs, solvent consumption, possible column clogging among others. The development of dispersive modes together with the use of nanoparticles, as sorbents due to their high surface area is an excellent alternative to overcome several limitations in the field of extraction. Additionally, if the nanoparticles used as sorbents are magnetic, the phase separation can be easily carried out with an external magnetic field, this approach is called magnetic solid phase extraction (MSPE). An innovative variant of the MSPE method is pipette-tip magnetic solid phase extraction (PT-MSPE), in which extraction and elution are performed in a pipette tip. Its ability to operate with small volumes of solvents, its speed and efficiency, and its high selectivity and sensitivity make it ideal for a wide range of analytical applications. Furthermore, its alignment with sustainability principles reinforces its attractiveness in the development of modern and environmentally responsible analytical methods. This work presents an innovative method for the determination of four sulfonamides in water, sulfamethoxazole (SMX), sulfathiazole (STZ), sulfamethoxypyridazine (SMP) and sulfamethazine (SMT), using magnetic nanoparticles embedded in a selective commercial sorbent by PT-MSPE prior to determination by liquid chromatography and ultraviolet detection. The PT-MSPE method was provided limits of detection and quantification of 0.78-2.6 µg L-1 and 6-20 µg L-1 , and enrichment factors up to 6.6. Also, it was positively evaluated by three environmental impact assessment tools of analytical processes.
- Detection of biogenic amines in urine and plasma by liquid chromatography coupled to electrochemical detection HPLC-ED using microextraction in packed syringe MEPSPublication . Oppolzer, David Jerónimo; Alba, Maria Eugénia Gallardo; Passarinha, Luís António PaulinoBiogenic amines are neurotransmitters involved in several physiological processes. Changes and disturbs in their function are associated to several neurological disorders or diseases, as well as consumption of psychotherapeutic or psychotropic drugs. The detection of these compounds in biological fluids is therefore of clinical and neurochemical interest. The goal of this work was to develop and validate and analytical method for the detection and quantification of the biogenic amines serotonin (5-HT), dopamine (DA) and norepinephrine (NE), using microextraction in packed syringe (MEPS) and liquid chromatography coupled to electrochemical detection (HPLC-ED) in both urine and plasma samples. The internal standard used was 3,4-dihydroxybenzylamine (DHBA). The MEPS extraction procedure was optimized using the design of experiments (DOE) tool, and the final conditions of 8 strokes, no washing, and two elutions of 100 FL methanol were chosen. The method was fully validated according to internationally accepted guidelines from the Food and Drug Administration. Linearity was established between 50-1000 ng/mL for 5-HT and between 5-1000 ng/mL for DA and NE, with determination coefficients (R2) higher than 0.99 for all compounds. The limits of detection and quantification were respectively 20 and 50 ng/mL for 5-HT, and 2 and 5 ng/mL for DA and NE. Intra- and interday precision ranged from 1 to 10 %, while accuracy was within a ±15% interval for all compounds. Authentic urine and plasma samples were analysed by the validated method, and the three compounds were detectable and quantifiable in urine, while only 5-HT was detected and quantified in plasma. This is the first time that a commercially available MEPS column was used for the simultaneous detection of biogenic amines in urine, and also the first time that 5-HT was detected and quantified in plasma using MEPS. MEPS proved to be fast to perform with the use of less solvent volumes, saving time and money and being less laborious. The validated method is useful for the determination of biogenic amines in laboratorial routine.
- Determinação da cocaína e seus metabolitos usando águas residuais como matrizPublication . Alves, Estefânia Raquel Silva; Pereira, André Ricardo Tomás dos Santos Araújo; Alba, Maria Eugénia Gallardo; Barroso, Mário Jorge DinisO consumo de drogas de abuso, entre as quais cocaína, existe há muitos anos e permanece até aos dias de hoje, representando um problema para a saúde pública. A cocaína (COC) é a segunda droga mais consumida a nível europeu, e por se tratar de uma substância que estimula o sistema nervoso central (SNC), encontra-se associada a diversas doenças físicas e mentais. Outro fator preocupante é o impacto na saúde mental provocado pela pandemia causada pelo coronavírus (covid-19), levando a um aumento do consumo deste tipo de substâncias. Desta forma, torna-se importante o desenvolvimento de novas metodologias que permitam detetar e quantificar de forma fiável estas drogas, podendo utilizar vias indiretas de forma a obter dados credíveis que indiquem informação sobre o consumo destas substâncias através de amostras de recolha fácil. Assim sendo, o presente estudo teve como objetivo desenvolver um método analítico adequado à análise de águas residuais (AR’s), utilizando extração em fase sólida (SPE) e identificação/quantificação, através da cromatografia gasosa (GC) e espetrometria de massas em tandem (GC-MS/MS). Os analitos alvo foram COC, ecgonina metilester (EME), benzoilecgonina (BEG), cocaetileno (COET) e norcocaína (NCOC). O procedimento de extração previamente otimizado, resultou na aplicação de 50 mL de amostras de efluentes em cartuchos StrataTM-X-C. A extração foi iniciada com o acondicionamento dos cartuchos com 2 mL de metanol e 2 mL de água desmineralizada, adição de amostra, seguido de uma lavagem onde foram usados 2 mL de ácido clorídrico (HCl) (0,1M em água), eluição dos compostos com 2 mL de 5% hidróxido de amónia em metanol secagem, derivatização e posterior injeção no sistema GC-MS/MS. A metodologia foi validada seguindo as diretrizes de Scientific Working group for Forensic Toxicology (SWGTOX). Foi obtida uma linearidade de 0,00625-5 ng/mL para todos os analitos em estudo, com coeficientes de superiores a 0,99 para todos os compostos. A precisão e exatidão intra- e interdia e intermedia revelaram coeficientes de variação e BIAS em conformidade com as diretrizes utilizadas. Este procedimento permitiu recuperações que variaram entre 72-115%. Todos os parâmetros estudados obedeceram aos critérios definidos. Um dos parâmetros avaliados durante o desenvolvimento do presente método foi a estabilidade, pois uma das maiores limitações dos laboratórios de toxicologia reside no armazenamento de amostras antes e depois do seu processamento, podendo resultar em perdas significativas dos compostos em estudo. Todos os analitos se mantiveram estáveis nos extratos à temperatura ambiente durante 24h e nas amostras sujeitas a ciclos de congelação/descongelação durante 24h. Salienta-se que o método aqui descrito, é o primeiro que utiliza SPE através de cartuchos StrataTM-X-C, aliada à análise por GC-MS/MS. Assim, este método constitui uma alternativa adequada para a monitorização da COC e dos seus metabolitos em amostras de águas residuais, com especial importância quer no ramo ambiental quer em termos de aplicação forense.
- Determinação de antidepressivos em águas residuais através da cromatografia gasosa acoplada à espetrometria de massa em tandemPublication . Catarro, Gonçalo Incenso Pereira; Soares, Sofia Pires Seixo; Alba, Maria Eugénia Gallardo; Pereira, André Ricardo Tomás dos Santos AraújoNos últimos anos, com a influência da pandemia de COVID-19, o número de casos de transtornos do foro psiquiátrico tem aumentado. Dentro destes transtornos encontra-se a depressão, uma patologia caracterizada por um padrão de tristeza, perda de interesse, entre outros sintomas e que afeta atualmente cerca de 50 milhões de europeus. A utilização de antidepressivos é a medida mais eficaz para o tratamento desta patologia e que tem levantado várias preocupações às entidades competentes devido ao fácil acesso a este tipo de medicamentos. De facto, no caso dos inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS) e dos inibidores seletivos da recaptação de serotonina e noradrenalina (ISRSN) houve um aumento de 30 e 45 %, respetivamente, na sua prescrição desde 2017. Estes fármacos representam também uma potencial ameaça à saúde pública e aos ecossistemas, devido a um aumento na negligência entre a população quanto ao seu descarte, o que leva a uma exacerbação da presença desses fármacos em águas residuais. Tais compostos são detetados tanto na forma de metabolitos quanto na forma inalterada, sendo esta última de maior preocupação, pois indica um descarte inadequado e tratamento ineficaz nas estações de tratamento de águas residuais (ETARs). Este estudo teve como objetivo desenvolver um método analítico para determinar diferentes fármacos que pertencem à classe de antidepressivos ISRS e ISRSN (fluoxetina (FLX), citalopram (CIT), sertralina (SRT), paroxetina (PXT) e venlafaxina (VLX)) usando a extração em fase sólida (SPE) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa em tandem (GC-MS/MS). A metodologia desenvolvida foi validada de acordo com as diretrizes da Food and Drug Administration. O procedimento de extração foi previamente otimizado, tendo-se testado quatro tipos de cartuchos de SPE diferentes, onde os cartuchos OASIS® PRIME MCX permitiram obter maiores rendimentos, pelo que foram estes os cartuchos selecionados para a realização do presente estudo. O método apresentou linearidade entre 0,049 (0,195) – 25 ng/mL, com coeficientes de determinação superiores a 0,99, limites de deteção entre 0,012 – 0,195 ng/mL e limites de quantificação entre 0,049 – 0,195 ng/mL. Adicionalmente foram avaliadas as precisões interdia, intermédia e intradia, assim como a exatidão, demonstrando coeficientes de variação inferiores a 15% (20% para o limite de quantificação). A recuperação do método compreendeu-se entre 7,28 – 81,14%, com resultados reprodutíveis e consistentes, e com os resultados do estudo de estabilidade verificou-se que em geral todos os compostos são estáveis, com exceção da PXT que demonstrou ser instável a baixas concentrações. Assim, este estudo, é o primeiro a utilizar cartuchos de SPE OASIS® PRIME MCX e a GC-MS/MS para a determinação de antidepressivos em águas residuais, demonstrando ser uma alternativa viável para a monitorização desta classe de fármacos em matrizes aquosas como rotina laboratorial, enfatizando sua importância ambiental.
- Determinação de antidepressivos em plasma e urinaPublication . Domingos, Ana Sofia Marques; Alba, Maria Eugénia GallardoOs casos de depressão têm vindo a aumentar cada vez mais. Muitas vezes por falta de diagnóstico atempado o tratamento inicial não é eficaz, o que faz com que o número de doentes crónicos continue a aumentar, aumentando consequentemente o consumo deste tipo de medicamentos. Em Portugal, os dados publicados pela Autoridade Nacional do Medicamento e Produtos de Saúde I.P. (INFARMED) referem que o subgrupo farmacoterapêutico antidepressivos e psicotrópicos estava, em 2000, entre os 10 primeiros no que diz respeito aos encargos para o Serviço Nacional de Saúde. A prescrição dos antidepressivos de nova geração, como os inibidores selectivos da recaptação da serotonina, tem sido crescente nos últimos anos, já que apresentam menos toxicidade para o organismo e um menor número de efeitos secundários. No entanto, nem sempre esta medicação é eficaz, continuando assim a prescrever-se antidepressivos tricíclicos e inibidores da monoaminoxidase, que apresentam uma elevada toxicidade e são muitas vezes usados em actos suicidas. O objectivo a que nos propusemos com este trabalho foi desenvolver e comparar várias técnicas para a preparação de amostras, como a extracção líquido-líquido (LLE) e a extracção em fase sólida (SPE), usando diferentes solventes e tipos de enchimento para a detecção de antidepressivos em plasma e urina. Os extractos foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada a um detector de fotodiodos (PDA). Foram estudados nove antidepressivos: amitriptilina, nortriptilina, clomipramina, dotiepina, mianserina, trazodona, fluoxetina, sertralina e protriptilina, tendo sido este último usado como padrão interno.Os parâmetros estudados foram a selectividade, recuperação e limites de detecção, tendo estes parâmetros sido avaliados de acordo com as normas internacionalmente aceites para a validação de métodos bioanalíticos. Os valores de recuperação obtidos situaram-se entre 16-82% para a LLE e 42-97% para a SPE. De um modo geral, as técnicas de SPE utilizadas demonstraram ser mais adequadas para a determinação deste tipo de compostos em fluidos biológicos, devido à presença de um número menor de interferências endógenas. Por outro lado, a simplicidade de execução desta técnica torna-a mais facilmente automatizável. Finalmente, foi ainda possível demonstrar que o tipo de equipamento analítico utilizado no decorrer deste trabalho (HPLC/PDA) é uma técnica útil e ao alcance de qualquer laboratório para uma primeira fase da optimização de processos extractivos, reservando-se técnicas mais dispendiosas [como por exemplo LC/MS (MS) ou UPLC/MS (MS)] para a posterior validação dos métodos analíticos desenvolvidos.
- Determinação de marcadores de exposição ao tabaco em amostras de fluido oral de indivíduos não fumadoresPublication . Fonseca, Beatriz Marques da; Alba, Maria Eugénia Gallardo; Calheiros, José Manuel Lage CampeloA exposição à poluição tabágica ambiental constitui um sério problema de saúde pública, já que os fumadores passivos estão expostos a mais de quatro mil substâncias tóxicas, entre as quais dezenas de cancerígenos e nicotina, principal agente responsável pelo desenvolvimento da dependência ao tabaco. Este alcalóide de ocorrência natural deriva das folhas de tabaco e é rápida e extensivamente metabolizado no fígado para formar uma larga variedade de metabolitos. A exposição crónica à nicotina, a droga mais consumida em todo o planeta, é responsável pela aparição de problemas de saúde como cancro, doenças do foro respiratório e neurológico, entre outros. Como problema de saúde pública, é uma prioridade conhecer a verdadeira prevalência de indivíduos expostos a este tipo de poluição. Assim o principal objectivo do presente estudo é a determinação de nicotina e os seus principais metabolitos, cotinina e trans-3- hidroxicotinina em amostras de fluido oral por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa em tandem, de forma a avaliar a exposição de não fumadores a estas substâncias. A metodologia proposta foi validada de acordo com critérios internacionalmente aceites para a validação de métodos bioanalíticos da Food and Drug Administration (FDA). Utilizando apenas 200 μL de amostra, o método demonstrou ser linear no intervalo de concentrações de 0,5 a 1000 ng/mL, exacto e preciso. Os limites de detecção e quantificação foram de 0,5 ng/mL e a eficiência de extracção foi superior a 85% para todos os compostos de estudo. Tendo em conta os resultados obtidos, podemos afirmar que a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa em tandem é uma poderosa e indispensável ferramenta que providencia uma elevada sensibilidade para a quantificação simultânea de biomarcadores de exposição ao fumo de tabaco num volume reduzido de fluido oral.
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