Departamento de Química
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Browsing Departamento de Química by Field of Science and Technology (FOS) "Engenharia e Tecnologia::Biotecnologia"
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- Administração Intranasal de Segesterona para Neuroproteção: Caracterização, Estabilidade, Libertação e Segurança In Vitro de FormulaçõesPublication . Silva, Samille Ferreira da; Santos, Adriana Oliveira dos; Peres, Carina Sofia GonçalvesO acidente vascular cerebral isquémico é uma das principais causas de morte e a principal causa de incapacidade a longo prazo em todo o mundo. Em razão do número reduzido de opções terapêuticas e das suas limitações, há necessidade de encontrar formas alternativas de prevenir e tratar casos de acidente vascular cerebral isquémico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar e avaliar a estabilidade física e química, a libertação do fármaco, e a segurança de formulações de acetato de segesterona (AS) previamente desenvolvidas, uma microemulsão (ME) e três nanoemulsões O/A, uma neutra (NEn), uma aniónica e viscosa (NEa) e uma catiónica (NEc), diluídas para se atingir uma concentração alvo de AS de cerca de 0,48 mg/mL. Foi desenvolvido e validado um ensaio de cromatografia líquida acoplado a deteção UV para a quantificação de acetato de segesterona. Testes de estabilidade física e química de longo prazo foram conduzidos a três temperaturas de armazenamento diferentes (4 °C, 25 °C e 40 °C) em dois lotes independentes. Perfis de libertação do AS in vitro foram caracterizados usando Câmaras de Ussing horizontal. Adicionalmente, a segurança das formulações foi testada usando um modelo comercial tridimensional de tecido nasal humano cultivado in vitro (MucilAirTM, Epithelix). Foi feita avaliação da resistência transepitelial (TEER, do Inglês transepithelial electrical resistance), da libertação de Lactato Deshidrgenase (LDH) para o meio basal e 0 ensaio de redução da resazurina. A respeito da estabilidade física, na ME houve aumento de tamanho médio e PDI ao longo do tempo a todas as temperaturas, embora mais acentuado a 40 °C. Foi ainda possível verificar a ocorrência de precipitação do fármaco, principalmente a 4 °C, mas isto poderia ser prevenindo reduzindo a concentração inicial do fármaco. Ainda assim, a 4 °C e 25 °C o tamanho médio de gotícula manteve-se < 100 nm e os valores de PDI < 0,3, que podem ser considerados valores aceitáveis. Quanto à NEa, esta foi apenas estável do ponto de vista de tamanho médio (< 200 nm) e PDI (< 0,2) apenas a 4 °C. A sua viscosidade manteve-se estável a 4 °C e 25 °C. A NEc manteve um tamanho médio próximo de 100 nm e PDI < 0,2 às 3 temperaturas, embora o PDI até tenha sido mais baixo a temperaturas = 25 °C. A NEn mostrou um tamanho médio dependente da temperatura, sendo significativamente mais baixo a 4 °C. O PDI não teve grandes variações a não ser a 40 °C, mas mantendo-se inferior a 0,2. Quanto à estabilidade química, esta foi influenciada pela precipitação observada na ME, que foi responsável pela redução do nível de fármaco quantificado na ME ao longo do tempo. Houve também uma redução da concentração do fármaco na NEa. Nos primeiros lotes de NEc e de NEn, a concentração de fármaco permaneceu relativamente estável ao longo do tempo. Contudo, houve uma diminuição da concentração de AS a 40 °C na NEc no lote 2. No que diz respeito ao perfil de libertação, foi possível constatar a rápida velocidade de libertação inicial, a partir das nanoemulsões neutras e catiónicas, semelhante ou ainda superior à velocidade conseguida com o controlo positivo, e a redução da velocidade de libertação a partir das formulações aniónicas, mais viscosas. As ME originaram resultados semelhantes aos obtidos com o controlo negativo. Contudo, nenhuma levou a uma libertação completa nas 6 h do estudo. Quanto à segurança in vitro, A ME foi segura à concentração usada e a NEn mais diluída (0,135 mg/mL AS) não levou a uma alteração significativa do TEER nem libertação de LDH, mas afetou inibiu parcialmente a redução da resazurina. As NEa, NEc e NEn impactaram o TEER e a redução da resazurina, mas a mucosa pareceu recuperar. A NEc pareceu mais tóxica, com diminuição mais acentuada do TEER e da metabolização de resazurina. Concluindo, as formulações mais estáveis foram as nanoemulsões neutras e catiónicas, a 4 °C e 25 °C, respetivamente. O perfil de libertação do fármaco a partir destas formulações é também mais rápido embora, não tenha sido completo. Em relação à segurança das formulações, as ME são mais seguras, o que era esperado. No entanto, todas as formulações foram mais seguras que os controlos positivos usados e permitiram a recuperação do TEER para valores normais. Em suma, tanto a ME como a NEn são bom candidatos para avançar para estudo in vivo de administração intranasal de AS, e podem vir a ser uma boa estratégia para explorar as propriedades neuroprotetoras do acetato de segesterona no acidente vascular cerebral isquémico.
- Aguardentes vínicas envelhecidas com diferentes tecnologiasPublication . Vitória, Cláudia Adriana Fernandes; Caldeira, Ilda Maria Justino; Anjos, Ofélia Maria Serralha dos; Alba, Maria Eugénia GallardoA aguardente vínica envelhecida é uma bebida com elevado teor alcoólico obtida através da destilação do vinho com posterior envelhecimento em contacto com madeira. Este envelhecimento é tradicionalmente realizado em vasilhas de madeira. Contudo, o uso de vasilhas envolve um processo moroso e dispendioso. Assim, começaram a surgir sistemas de envelhecimento alternativos para colmatar esta necessidade de tornar o processo mais sustentável. O destilado de vinho, a madeira utilizada no envelhecimento e todas interações existentes ao longo do processo de produção da aguardente são a fonte dos compostos voláteis odorantes que tornam a aguardente uma bebida com elevada complexidade aromática. Este trabalho consistiu em compreender se o uso de diferentes sistemas de envelhecimento (tradicional – vasilha de madeira; ou alternativo – garrafões de vidro com aduelas mergulhadas e com diferentes níveis de microxigenação), diferentes madeiras (castanheiro ou carvalho Limousin) e/ou tempo de conservação em garrafa têm influência no aroma da aguardente vínica Lourinhã. A influência no aroma foi avaliada pela análise dos compostos voláteis com recurso a cromatografia de gases acoplada à espetrometria de massa (GC-MS) e cromatografia de gases acoplada a um detetor de ionização de chama (GC-FID) e pela análise sensorial recorrendo a um painel de provadores e realizando uma análise descritiva quantitativa. Os resultados corroboraram estudos anteriores acerca do uso do sistema alternativo e/ou da madeira de castanheiro serem uma boa opção no envelhecimento de aguardentes e estuda, pela primeira vez, a evolução desta bebida em garrafa, comprovando uma melhoria do aroma durante a conservação em garrafa.
- Alteração dos estabilizantes e espessantes de preparados de fruta e as suas implicaçõesPublication . Soares, Maria Inês Paulo; Soares, Ana Vaz de Figueiredo; Luís, Ângelo Filipe Santos; Rodrigues, Ana Sofia dos SantosA indústria de produção de iogurtes enfrenta constantes desafios, impulsionados pela crescente preferência dos consumidores por produtos mais naturais e saudáveis. Um dos principais aspetos que tem sido alvo de atenção é a procura por ingredientes de origem natural, levando à substituição do amido modificado pelo amido nativo, bem como da carragenina por pectina, goma guar e goma xantana. Estas modificações visam atender à demanda por produtos com um "clean label". Neste contexto, este trabalho teve como objetivo investigar como as mudanças nos estabilizantes e espessantes dos preparados de fruta afetam as propriedades dos iogurtes, incluindo textura e pH, ao longo do tempo de armazenamento e com base em estudos reológicos que permitem compreender o comportamento dos preparados sujeitos a essas alterações. Os resultados indicam que as alterações nos estabilizantes e espessantes em preparados de fruta exercem um papel significativo nas propriedades físicas e químicas dos iogurtes. A análise reológica dos preparados de fruta revelou a importância de manter perfis reológicos consistentes, fundamental para a eficiência do processo industrial. Estes resultados contribuem não apenas para o avanço da indústria de iogurtes, como também atendem à crescente procura por produtos que reflitam os critérios de um "clean label". Destaca-se a importância de escolher cuidadosamente os ingredientes e formulações, visando um processo mais eficiente e produtos de maior qualidade, alinhados com as preferências dos consumidores por produtos mais naturais e saudáveis.
- Análise dos procedimentos aplicáveis ao processo de produção de preparados de fruta e cereaisPublication . Alves, Pedro Filipe Lopes; Ferreira, Susana Margarida Paraíso; Santos, Natália NogueiraO presente relatório de estágio curricular visa apresentar o trabalho desenvolvido na análise dos procedimentos aplicáveis ao processo de produção de preparados de fruta e cereais, durante o estágio integrado nas unidades do Ferro e Tortosendo da empresa Frulact, empresa que fornece ingredientes de valor acrescentado para as indústrias alimentares e de bebidas. De forma a poder enquadrar à análise dos procedimentos, este relatório encontrase dividido em secções, onde no início é descrita a legislação em vigor e normas aplicadas pela empresa relacionadas com a segurança alimentar. Assim, é inicialmente descrito, a história da segurança alimentar, referindo a sua importância e as razões que levaram ao surgimento da Análise de Perigos e Controlo de Pontos Críticos (do inglês Hazard Analysis and Critical Control Point – HACCP), o que se considera como alimento seguro, os perigos e aborda-se brevemente a regulamentação HACCP aplicada na União Europeia e as normas aplicadas pela Frulact. No segundo tópico relacionado com a empresa é descrita a sua organização global, os seus objetivos, visão, a sua organização por departamentos e os processos realizados nas unidades relativas a este estudo situadas no Ferro e no Tortosendo, considerando as medidas de controlo aplicadas para cumprir com as normas legais em vigor para o sector. Por fim, é narrado o processo de análise critica dos procedimentos aplicados ao processo de produção de preparados de fruta e cereais analisando a documentação em uso considerando o HACCP e as normas de segurança alimentar.
- Aplicação de membranas para clarificação e/ou purificação de um vetor de DNA minicircularPublication . Carvalho, Daniela Maria Domingos de; Sousa, Ângela Maria Almeida de; Valente, Joana Filipa Abreu Pereira; Alves, Nuno Manuel FernandesO cancro do colo do útero é um dos cancros mais prevalentes em mulheres em todo o mundo. Este tipo de cancro é causado pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV), nomeadamente pelos seus genótipos de alto risco mais virulentos, o HPV-16 e o HPV-18. Após uma infeção persistente, as oncoproteínas E6 e E7 expressas por esses vírus são responsáveis pela inibição e degradação das proteínas supressoras de tumor p53 e pRB, respetivamente. A terapia génica tem sido explorada nos últimos anos devido ao seu potencial no tratamento de doenças adquiridas e incuráveis. Esta abordagem terapêutica baseia-se na entrega de uma sequência específica de DNA exógeno a uma célula hospedeira, para alterar a função de uma determinada molécula que pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento de uma doença. O DNA minicircular (mcDNA) tornouse um vetor de DNA não viral promissor, porque carece de sequências procarióticas consideradas prejudiciais (como genes de resistência a antibióticos, origem de replicação e motivos CpG, geralmente associados a questões de segurança) e, porque é um vetor de menor dimensão quando comparado com o DNA plasmídico convencional (pDNA), apresentando assim melhor eficiência de transfeção, permanência celular e expressão génica. Adicionalmente, os micro RNAs foram identificados como silenciadores de genes que degradam ou inativam um RNA mensageiro específico. Particularmente, foi comprovado que o micro-RNA-375 (miR-375) silencia a expressão das oncoproteínas E6 e E7 em células infetadas por HPV de alto risco. Assim, o presente trabalho visa a produção e purificação de um vetor de mcDNA que codifica o gene pri-miR-375, que futuramente poderá ser utilizado para terapia génica contra o cancro do colo do útero. No entanto, o processo biotecnológico para obtenção de mcDNA envolve várias etapas (nomeadamente centrifugações; concentração com solventes orgânicos; clarificação com altas concentrações de sal; métodos de purificação que consistem em cromatografia de exclusão molecular ou cromatografia de afinidade que são demorados ou não estão disponíveis comercialmente, respetivamente) que tornam o processo downstream bastante caro do ponto de vista da indústria farmacêutica, mostrando assim a necessidade do desenvolvimento de estratégias alternativas. Neste sentido, a presente dissertação sugere uma nova abordagem de recuperação do mcDNA, baseada no tratamento de lisado bruto com terra diatomácea para filtração direta e remoção de todos os detritos celulares e impurezas precipitadas, combinada com uma segunda etapa usando uma membrana cromatográfica Sartobindâ para purificar o DNA eliminando o RNA. Esta abordagem permite a substituição de várias etapas préestabelecidas para a preparação do lisado, nomeadamente a centrifugação dos restos celulares no final da lise alcalina, a etapa de concentração com isopropanol (e respetiva centrifugação) e a etapa de clarificação com sulfato de amónio (e respetiva centrifugação) poupando deste modo recursos, muito tempo ao processo global e, diminuindo o impacto ambiental. Na etapa de purificação, foi explorada a cromatografia de troca aniónica usando duas membranas, a Sartobind® Q75 e a Sartobind® D75. Após alguns estudos preliminares das condições de equilíbrio e eluição, foi otimizada a eliminação de grande quantidade de RNA diretamente no flowthrough, depois do carregamento da amostra de lisado simplificado, e o restante RNA foi eliminado durante um gradiente crescente de NaCl. A eficiência de ambas as etapas deste processo combinado foi comprovada através da quantificação das amostras recuperadas no final de cada etapa, usando uma coluna analítica CIMac™ pDNA e por fim a densidade de bandas do gel de agarose. No geral, os estudos realizados demonstraram a eficiência da estratégia combinada. Esta nova abordagem de preparação do lisado simplificada torna o processo mais rápido, passando a ser realizado em cerca de 40 min, enquanto que a abordagem convencional demora aproximadamente 180 min. Quanto à purificação do lisado, com a membrana Sartobind® Q75 foi possível obter uma recuperação quase total do DNA (» 100%), com uma pureza superior a 99%. No entanto, ainda é necessário realizar mais alguns estudos para melhorar o isolamento e o rendimento máximo do vetor mcDNA recuperado. Assim, espera-se que esta estratégia combinada possa ser ampliada e aplicada com sucesso na indústria farmacêutica para purificar vetores de DNA de forma rápida e económica.
- Avaliação da Qualidade Microbiológica das Águas – Matrizes e MetodologiasPublication . Afonso, Bárbara Sofia Patrício Marcos; Luís, Ângelo Filipe Santos; Lourenço, Maria Paula Tenreiro da Cruz Matoso MartinhoA água é a base da vida, é por isso primordial garantir a sua qualidade. Existem inúmeros microrganismos que podem ser transmitidos pela água e que podem causar danos graves na saúde humana e consequentemente na Saúde Pública. A qualidade da água deve ser garantida privilegiando a prevenção através de controlos periódicos. A análise microbiológica das águas é uma forma eficaz, eficiente que permite detetar microrganismos patogénicos que podem pôr em causa a Saúde Pública. Ao longo deste estágio realizaram-se analises microbiológicas de diversos tipos de matrizes, através de diferentes métodos culturais. A pesquisa dos microrganismos foi feita de acordo com a legislação adequada a cada tipo de matriz. Constatou-se que as águas que chegam ao Laboratório de Saúde Pública da Unidade Local de Saúde da Guarda não apresentam uma carga microbiana muito elevada e que os métodos usados no laboratório são fiáveis e efetivos para a prevenção e promoção da saúde.
- Avaliação da toxicidade em lixiviados de aterro sanitário tratados eletroquimicamentePublication . Silva, Wilson Daniel Araújo da; Fernandes, Annabel Dias Barrocas; Pastorinho, Manuel Ramiro DiasAtualmente, a deposição em aterro sanitário é o método mais económico e utilizado na gestão de resíduos sólidos urbanos. Uma consequência inevitável da deposição de resíduos em aterro é a produção de lixiviados, efluentes líquidos resultantes do balanço hídrico dos aterros e da percolação da água na massa de resíduos, que extrai e arrasta consigo diversos materiais dissolvidos e/ou em suspensão. Devido à sua composição, os lixiviados de aterro constituem um importante problema ambiental, com efeitos tóxicos conhecidos. O seu tratamento é um dos maiores desafios na gestão de resíduos sólidos urbanos. Nos últimos anos, a aplicação de processos eletroquímicos no tratamento deste tipo de efluentes tem sido objeto de estudo, com resultados bastante promissores. No entanto, a maioria dos estudos existentes restringe- se apenas à remoção de contaminantes, sendo a influência do tratamento eletroquímico na toxicidade do lixiviado ainda pouco conhecida. Neste trabalho, foi avaliada a eficiência da oxidação eletroquímica no tratamento de lixiviados de aterro sanitário, quer pela redução de parâmetros físico-químicos, quer pela redução da ecotoxicidade. A toxicidade aguda do lixiviado, antes e depois do tratamento eletroquímico, foi avaliada através do organismo modelo Daphnia magna, recomendado pelas principais organizações internacionais, nomeadamente a American Society for Testing and Materials (ASTM), Organização para Cooperação e Desenvolvimento Económico (OCDE) e Organização Internacional de Normalização (ISO). O tratamento do lixiviado por oxidação eletroquímica mostrou-se eficaz na remoção da carga orgânica e azoto amoniacal, e na redução da concentração de iões metálicos. Além disso, observou-se uma redução de 2,5 vezes na toxicidade aguda para o organismo D. magna após 36 h de tratamento. No entanto, a toxicidade do lixiviado tratado ainda é muito elevada, sendo necessária a aplicação de outros tratamentos para obter um efluente não tóxico para este organismo aquático.
- Avaliação das condições de crescimento da Serratia plymuthica para produção de prodigiosinaPublication . Giacomelli, Felipe Ozorio; Gouveia, Isabel Cristina Aguiar de Sousa e SilvaA cor é uma das principais características dos objetos que nos rodeiam e enquanto consumidores é um fator determinante na seleção de qualquer produto. A tendência mundial para uso de produtos mais “eco-friendly” e naturais está em grande expansão, e nesse mercado os pigmentos microbianos surgem como uma alternativa na substituição de corantes sintéticos em diferentes indústrias. A prodigiosina produzida por Serratia plymuthica, bactéria gram negativa da família das Enterobacteriaceae, é um metabólito secundário de produção intracelular. Para além do potencial de tingimento, possui atividades biológicas (antifúngica, imunossupressora, anticancerígena e antimicrobiana) que podem ser exploradas, proporcionando a obtenção de materiais multifuncionais. O presente estudo teve por objetivo produzir o pigmento prodigiosina, alcançar as melhores condições de crescimento da bactéria e produção do pigmento, definir a concentração mínima inibitória (MIC) do pigmento contra Staphylococcus aureus (SA) e Pseudomonas aeruginosa (PA), funcionalizar uma amostra têxtil de algodão e avaliar o efeito antibacteriano da prodigiosina após processo de funcionalização no algodão. As melhores condições de cultivo alcançadas foram em incubações a 22ºC ± 2ºC por 48h em meio de cultura PGP (glicerol como fonte de carbono e peptona como fonte de nitrogénio), taxa de oxigenação correspondente a 20% (v/v) e agitação (nos cultivos submersos) entre 150 e 200rpm. Obteve-se valores de MIC de 0,24 ?g/mL e 1,25 mg/mL para, respectivamente, SA e PA. E a avaliação da eficácia da funcionalização demonstrou que o pigmento ficou ligado a fibra e possui atividade antibacteriana, pois reduziu o crescimento bacteriano em 97,10% (SA) e 45,26% (PA), em comparação com resultados da amostra sem prodigiosina.
- Avaliação de águas superficiais como reservatório de Campylobacter e Arcobacter sensu latoPublication . Venâncio, Igor Miguel Antunes; Ferreira, Susana Margarida Paraíso; Oleastro, Mónica Alexandra de SousaAs bactérias do género Campylobacter e do grupo Arcobacter sensu lato são bacilos de Gramnegativo, pertencentes à família Campylobacteraceae. Até ao momento, 35 espécies foram reconhecidas no género Campylobacter, e 31 no grupo Arcobacter sensu lato, sendo que entre elas, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Aliarcobacter butzleri, Aliarcobacter cryaerophilus e Aliarcobacter skirrowii, são as principais espécies associadas a infeções em humanos e animais. Embora exijam um hospedeiro, as bactérias do género Campylobacter são comumente isoladas de amostras de águas naturais, como nascentes, rios e lagos. De igual forma, mais de metade das espécies de Arcobacter sensu lato foram isoladas a partir de ambientes aquáticos. Esta situação revela-se como uma importante ameaça à saúde pública devido ao contacto direto do Homem com este tipo de águas. Esta preocupação é acrescida pela associação de surtos de doenças com o consumo de água contaminada com estas bactérias, sendo esta uma importante via de transmissão. Assim, o objetivo deste estudo focou-se na avaliação da distribuição de Campylobacter spp. e Arcobacter sensu lato em diferentes amostras de água, nomeadamente água de rio, água de afluentes e água de nascente não tratada, recolhidas no concelho da Covilhã, e avaliação da sua resistência a 7 antibióticos, normalmente utilizados no tratamento de infeções por estes microrganismos. Pela análise dos resultados, das 150 amostras analisadas por duas metodologias de deteção distintas, PCR e cultura, 56 (37,3 %) foram positivas para Campylobacter spp. quando utilizada deteção direta por PCR no meio de enriquecimento, e por isolamento 22 (14,6 %) revelaram a presença deste género; no total 60 amostras foram positivas por ambos os métodos. Em 8 de 22 amostras (36,4%) foi identificado C. jejuni, em 7 (31,4 %) C. coli, em 4 (18,2 %) C. lari, e 1 (4,5 %) foi positiva para C. upsaliensis, sendo que para duas amostras não foi possível obter uma identificação a nível de espécie. Em relação a Arcobacter sensu lato, também alguma variabilidade foi encontrada aquando da utilização destas duas metodologias, onde 72 de 150 amostras (48 %) foram positivas para o género quando utilizada deteção direta por PCR no meio de enriquecimento, e através de cultura foi possível o isolamento de bactérias deste grupo em 89 (59,3%) amostras; no total 99 amostras foram positivas considerando ambos os métodos. Em 74 das 89 amostras (83,1%) foram identificadas como positivas para A. butzleri, 20 (22,5%) para A. cryaerophilus e 28 amostras encontravam-se contaminadas por outras espécies de Arcobacter. Pela avaliação da diversidade genética, pela técnica de reação em cadeia da polimerase por consenso intergénico repetitivo enterobacteriano (ERIC-PCR - do inglês enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR), foi observada uma grande heterogeneidade genética entre os isolados de ambos os grupos bacterianos, registando-se 37 perfis genéticos diferentes entre os isolados provenientes das 22 amostras positivas para Campylobacter spp., e da mesma forma foram observados 255 perfis únicos de um total de 291 isolados de Arcobacter sensu lato. Quando avaliado o perfil de suscetibilidade a antibióticos, foram observadas diferenças nos perfis de resistência entre ambos os grupos bacterianos. Desta forma, para além de resistências pontuais, observou-se uma baixa multirresistência para o género Campylobacter, em apenas 2 dos 25 isolados avaliados, tendo-se obtido valores superiores para Arcobacter sensu lato, onde de um total de 238 isolados, 194 mostraram perfil de multirresistência, tendo-se verificado casos em que a resistência foi transversal a seis dos sete antibióticos testados. Assim, os resultados deste estudo demonstram uma elevada prevalência de Campylobacter spp e Arcobacter sensu lato, agravada pela alta resistência a antibióticos encontrada, em amostras de água superficial de acesso ao homem, apresentando não só alto risco para a população e animais da região, mas também para uma possível contaminação de alimentos.
- Bioreconhecimento de DNA minicircular por derivados de aminoácidos imobilizados em suportes monolíticosPublication . Pais, Vânia Nascimento; Sousa, Fani Pereira de; Sousa, Ângela Maria Almeida deAtualmente existem diversas patologias que afetam a sociedade, cujas terapias disponíveis não são adequadas, vitimando uma parte da população. A terapia génica e as vacinas de DNA são uma alternativa promissora que visa a administração de DNA que permite que o organismo expresse dada proteína/informação necessária para o tratamento da doença. Os plasmídeos têm sido o meio de entrega do DNA não viral mais utilizados, contudo são constituídos por genes necessários para a produção e replicação nos respetivos hospedeiros que quando administrados em humanos podem causar respostas inflamatórias e imunitárias. Neste contexto, surge o DNA minicircular (mcDNA) como uma tecnologia altamente promissora visto que é constituído unicamente pelos genes de expressão eucariota, necessários para a expressão do gene terapêutico. O mcDNA é por isso considerado um vetor de DNA mais seguro e está associado a um elevado efeito terapêutico, sendo necessário o desenvolvimento de metodologias eficientes para a sua purificação. Neste projeto foi usada a cromatografia de afinidade com derivados de aminoácidos (agmatina e histamina) como ligandos, para estabelecer um método eficaz de purificação do mcDNA. Para o alcance dos melhores resultados possíveis quando aplicada cromatografia de afinidade é essencial um conhecimento minucioso do tipo de interações que se estabelecem entre a amostra injetada e os derivados de aminoácidos estudados. Neste estudo, verificou-se que para o caso da agmatina estabelecem-se maioritariamente interações eletrostáticas para valores de pH inferiores ao pKa e que estas são intensificadas com a diminuição do pH. Observou-se também uma preferência por parte do monolito para a isoforma sc provavelmente devido à maior exposição das bases que assim permite que se intensifiquem outras interações como interações catião-p e interações por pontes de hidrogénio entre as aminas da agmatina e preferencialmente as guaninas da isoforma sc do mcDNA. Relativamente à histamina, apesar de não se ter conseguido estabelecer uma estratégia de purificação, foi também estudado um possível bioreconhecimento do mcDNA para com este derivado de aminoácido. E observou-se que quando utilizado NaCl há também uma preferência por interações eletrostáticas quando aplicados valores de pH inferiores ao pKa, pois assim o ligando apresenta uma carga global positiva que, por conseguinte, interage fortemente com a carga negativa do DNA conferida pelos grupos fosfato. Relativamente à estratégia de eluição com recurso a sulfato de amónio não foi concretizável visto que não se conseguiu obter seletividade, no entanto esta estratégia é menos interessante do ponto de vista industrial dada a implicação ambiental negativa associada ao sulfato de amónio. Após o estudo das diversas condições definiu-se que o suporte mais promissor para a purificação do mcDNA era o monolito modificado com agmatina, usando como gradiente a estratégia por passos com as seguintes concentrações de NaCl: 0 M, 1,5 M, 2,25 M e 2,7 M em 10 mM de tampão Tris-HCl. A biomolécula de interesse eluiu a 2,7 M de NaCl, no entanto verificou-se uma grande perda desta nos passos anteriores. Contudo, neste tipo de estudo, por vezes é necessário comprometer a recuperação de modo a conseguir a pureza adequada. Desta forma, a estratégia desenvolvida neste trabalho permitiu uma separação eficaz da isoforma sc do mcDNA, embora se tenha comprometido parte da biomolécula de interesse nos passos iniciais. De uma forma sucinta, a utilização do suporte monolítico modificado com agmatina pode ser uma solução para a purificação da isoforma sc do mcDNA para uma posterior aplicação terapêutica.